Phenolic compounds from the bark of Swietenia microphylla

Abstract

Meliaceae, a large plant family with approximately 50 genera and 650 known species, mostly distributed in the pantropical regions of the world. Swietenia, a genus of the family Meliaceae, comprises 7−8 species which was widely used in the manufacture of furniture, food and traditional medicine. Previous studies revealed that Swietenia mainly contained limonoids, terpenoids, steroids and phenolic compounds. Antibacterial, antifungal, antimalarial, anticancer, antiviral activities of the isolated compounds and extracts of the genus were also reported. Swietenia microphylla is a species of genus Swietenia whose phytochemical composition and biological activities have not been studied. This paper showed the results of isolation and structural elucidation of five phenolic compounds from an ethyl acetate extract of Swietenia microphylla bark, collected at Trang Bom botanical garden, Dong Nai province. Dried and ground barks of the species were extracted with ethyl acetate by Soxhlet extraction. The ethyl acetate extract, obtained after removal of the solvent via rotary evaporation, was separated using column chromatography on silica gel and Sephadex LH-20. Chemical structures of isolated compounds were elucidated by analysis of 1D, 2D-NMR, HRESIMS spectra and comparison of the spectral data with relevant literature. They were identified as scopoletin (1), 3,4-dihydroxybenzoic acid (2), (+)-epiafzelechin (3) and a mixture at a 6:4 ratio of (+)-catechin (4) and (+)-epicatechin (5). All the compounds have been reported for the first time from this species.

GIỚI THIỆU

Họ Xoan (Meliaceae), tên gọi khác là họ Dái ngựa, là một họ lớn trong nhóm thực vật có hoa với khoảng 50 chi và 650 loài phân bố khắp vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và số ít ở vùng ôn đới. Chi Swietenia thuộc họ Xoan, không những được biết đến là nguồn cung cấp gỗ có giá trị kinh tế cao mà còn được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh khác nhau như đái tháo đường, làm se vết thương, bệnh leishmania, sốt rét 1 , 2 , 3 , 4 . Ở Việt Nam, họ Xoan có khoảng 20 chi, bao gồm cả Swietenia , với khoảng 65 loài được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực lâm nghiệp, công nghiệp, thực phẩm và y học cổ truyền 5 . Kết quả nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học cho thấy các loài thuộc chi Swietenia chứa chủ yếu là limonoid, ngoài ra còn có terpenoid, steroid và hợp chất phenol 6 . Các hợp chất phân lập đã được thử nghiệm và thể hiện hoạt tính sinh học khá đa dạng như khả năng trừ sâu, kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, kháng ung thư, kháng virus và kháng oxy hóa 7 , 8 , 9 , 10 . Vì thế, các loài loài thực vật thuộc chi này được xem là một trong những nguồn nguyên liệu dồi dào cung cấp hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học giá trị. Xà cừ lá nhỏ ( Swietenia microphylla ) được biết đến là loài cây lấy gỗ, được trồng với mục đích phủ xanh đất trống và cung cấp gỗ cho vùng Đông Nam Bộ. Cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này. Tiếp nối ý nghĩa của các nghiên cứu về chi Swietenia , bài báo này trình bày quy trình phân lập và xác định cấu trúc hóa học một số hợp chất hóa học từ vỏ cây xà cừ lá nhỏ ( Swietenia microphylla ).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Đối tượng nghiên cứu

Vỏ cây xà cừ lá nhỏ ( S. microphylla ) thu hái tại vườn ươm thực vật Trảng Bom, phân hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp, tỉnh Đồng Nai vào tháng 01/2019, do TS. Đặng Việt Hùng, trường Đại học Lâm Nghiệp, phân hiệu Đồng Nai định danh.

Hóa chất và thiết bị

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo trên máy Bruker Avance III 500 [500 MHz ( ¹ H) và 125 MHz ( ¹³ C)] với CDCl ₃ hoặc acetone- d ₆ là dung môi, độ dịch chuyển hóa học (tính bằng ppm) được hiệu chỉnh dựa trên độ dịch chuyển hóa học của dung môi sử dụng. Khối phổ phân giải cao (HRESIMS) ghi trên máy X500 _R QTOF và Shimadzu IT-TOF. Năng lực triền quang đo trên triền quang kế A. Krüss Optronic. Sắc ký cột (SKC) được thực hiện trên silica gel 60 (40-63 µm, Merck). Sắc ký lớp mỏng (SKLM) được thực hiện trên bản silica gel 60 F ₂₅₄ (250 m, Merck) và RP-18 (250 µm, Merck). Cấu tử trên bản mỏng được phát hiện bằng đèn tử ngoại hoặc phun với dung dịch vanillin−acid sulfuric trong EtOH rồi nung nóng. Dung môi để thực hiện chiết xuất và phân lập chất đều được chưng cất lại trước khi sử dụng.

Chiết xuất và phân lập

Vỏ cây sau khi thu hái được phơi khô tự nhiên, xay nhỏ. Trích kiệt mẫu (14 kg) bằng bộ chiết Soxhlet với EtOAc, cô quay thu hồi dung môi thu được cao EtOAc, ký hiệu là SME. SKC cao SME (890 g) trên silica gel ( n -hexane-acetone, 0-100%) thu được tám phân đoạn (SME1−8). SKC phân đoạn SME5 (103,2 g) trên silica gel ( n -hexane-acetone, 0-100%) thu được năm phân đoạn (SME5.1−5). Thực hiện SKC phân đoạn SME5.3 (32,3 g) nhiều lần trên silica gel với hệ dung môi n -hexane-acetone (0-100%) thu được phân đoạn SME5.3.2.1−6. Tiếp tục SKC phân đoạn SME5.3.2.1 trên silica gel bằng hệ dung môi n -hexane-chloroform-acetone (70:27:3), sau đó tinh chế phân đoạn SME5.3.2.1.3 (20 mg) bằng SKC trên silica gel ( n -hexane-EtOAc, 0-100%) thu được scopoletin ( 1 ; 7,0 mg). Phân đoạn SME5.3.2.4 (601,9 mg) được SKC trên silica gel bằng hệ dung môi n -hexane-chloroform (50-100%) thu được tám phân đoạn (SME5.3.2.4.1−8). SKC phân đoạn SME5.3.2.4.6 trên silica gel ( n -hexane-EtOAc 0-100%) và tinh chế lại bằng hệ dung môi n -hexane-acetone (0-100%) thu được (+)-epiafzelechin ( 3 ; 3,0 mg). Tiến hành SKC phân đoạn SME5.3.2.5 (1,11 g) trên silica gel bằng hệ dung môi n -hexane-acetone (0-100%) thu được năm phân đoạn. Phân đoạn SME5.3.2.5.4 (823,2 mg) được SKC trên silica gel (chloroform-MeOH. 0-50%), sau đó tiếp tục thực hiện SK lọc gel trên Sephadex LH-20 (chloroform-MeOH, 50%) và tinh chế lại bằng SKC trên silica gel ( n -hexane-acetone, 0-70%) thu được hỗn hợp (+)-catechin và (+)-epicatechin ( 4 và 5 ; 10,6 mg). SKC phân đoạn SME5.3.5 (19,7 g) trên silica gel ( n -hexane-EtOAc, 0-100%) thu được 9 phân đoạn (SME5.3.5.1-9). Thực hiện SKC phân đoạn SME5.3.5.3 (6,25 g) trên silica gel ( n -hexane-EtOAc 0-100%) thu được 8 phân đoạn (SME5.3.5.3.1−8). Chọn phân đoạn SME5.3.5.3.4 (27 mg) tiếp tục SKC trên silica gel (dichloromethane-EtOAc, 0-100%), và tinh chế lại bằng SKC trên silica gel ( n -hexane-acetone, 0-100%) thu được 3,4-dihydroxybenzoic acid ( 2 ; 3,5 mg).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Xác định cấu trúc

Từ cao EtOAc của vỏ cây xà cừ lá nhỏ, ba hợp chất là scopoletin ( 1 ), 3,4-dihydroxybenzoic acid ( 2 ), (+)-epiafzelechin ( 3 ) và một hỗn hợp gồm (+)-catechin ( 4 ) và (+)-epicatechin ( 5 ) đã được phân lập ( Figure 1 ).

Figure 1 . Cấu trúc hóa học của 1 - 5

Hợp chất 1 thu được dưới dạng bột màu vàng. Phổ HRESIMS cho tín hiệu của mũi ion phân tử giả [M+H] ⁺ ở m/z 193,0458, tương ứng với công thức phân tử C ₁₀ H ₈ O ₄ . Phổ ¹ H và ¹³ C NMR (CDCl ₃ ) cho các tín hiệu cộng hưởng của một carbon carbonyl [ 161,6 (s, C-2)], một nối đôi C=C mang hai proton ghép cặp cis [δ _H 7,59 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-4) và 6,26 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3); 143,4 (C-4) và 107,7 (C-3)], một vòng benzene 1,2,4,5-tứ hoán [ 6,84 (1H, s, H-8) và 6,91 (1H, s, H-5); 150,4 (s; C-7); 149,9 (C-9); 144,2 (C-6); 113,6 (C-5); 111,6 (C-10) và 103,4 (C-8)] và một nhóm methoxy [δ _H 3,95 (3H; s; 6-OCH ₃ ); 56,6 (6-OCH ₃ )]. So sánh các số liệu phổ của 1 với tài liệu tham khảo 11 xác nhận hợp chất là scopoletin.

Hợp chất 2 thu được dưới dạng bột màu trắng. Phổ HRESIMS cho tín hiệu của mũi ion [M-H] ^- ở m/z 153,0186, tương ứng với công thức phân tử C ₇ H ₆ O ₄ . Phổ ¹ H và ¹³ C NMR (acetone- d ₆ ) cho các tín hiệu cộng hưởng của một carbon carbonyl [ 167,6 (C-7)] và một vòng benzene 1,2,4-tam hoán [ 7,52 (1H, d, J = 2,0 Hz; H-2); 7,47 (1H, dd, J = 8,3 và 2,0 Hz; H-6) và 6,89 (1H, d, J = 8,3; H-5); 150,8 (C-4); 145,6 (C-3); 123,6 (C-6); 123,2 (C-1); 117,5 (C-2) và 115,7 (C-5)]. So sánh các số liệu phổ của 2 với tài liệu tham khảo 12 xác nhận hợp chất là 3,4-dihydroxybenzoic acid.

Hợp chất 3 thu được dưới dạng bột màu trắng, +252.8 ( c 0.4 trong MeOH). Phổ HRESIMS cho tín hiệu của mũi ion [M-H] ^- ở m/z 273,0784, tương ứng với công thức phân tử C ₁₅ H ₁₄ O ₅ . Phổ ¹ H NMR (acetone- d ₆ , Table 1 ) cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với proton của một vòng benzene 1,4-nhị hoán [δ _H 7,36 (2H, brd, J = 8,5 Hz, H-2’, 6’) và 6,81 (2H, brd, J = 8,5 Hz, H-3’, 5’)] và một vòng benzene 1,2,3,5-tứ hoán [(δ _H 6,03 (1H, d, J = 2,2 Hz; H-6) và 5,92 (1H, d, J = 2,2 Hz; H-8)]. Ngoài ra còn có tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm oxymethine [(δ _H 4,93 (1H, s, H-2) và 3,58 (1H, d, J = 5,8 Hz; H-3), một nhóm methylene [δ _H 2,88 (1H, dd, J = 16,6 và 4,6 Hz; H _a -4) và 2,75 (1H; dd; J = 16,6 và 3,1 Hz; H _b -4)] và proton của ba nhóm hydroxy [(δ _H 8,25 (1H, s, 4’-OH); 8,12 (1H, s, 5-OH) và 7,94 (1H, s, 7-OH)]. Phổ ¹³ C NMR (acetone- d ₆ , Table 1 ) cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 15 carbon, trong đó có 12 carbon hương phương với bốn carbon mang oxygen [(δ _C 157,7 (C-5, 7, 4’) và 157,2 (C-8a)], hai carbon mang nhóm thế [(δ _C 131,5 (C-1’) và 99,8 (C-4a)] và sáu carbon mang proton. Ngoài ra còn có tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm oxymethine [δ _C 79,5 (C-2) và 66,9 (C-3)] và một nhóm methylene [δ _C 29,2 (C-4)]. Các số liệu phổ trên giúp dự đoán 3 là một flavanol.

Cấu trúc hóa học của 3 được xác định bằng phổ HMBC ( Figure 2 A). Trong phổ HMBC, hai proton hương phương ghép cặp ortho của vòng benzene 1,4-nhị hoán ở δ _H 7,36 (H-2’, 6’) cho tương quan với một carbon thơm mang oxygen (δ _C 157,7) và một carbon sp ³ của nhóm oxymethine (δ _C 79,5) nên hai carbon này lần lượt là C-4’ và C-2. Như vậy có thể xác định được đây là vòng B gắn vào C-2. Ở vòng C, proton oxymethine ở δ _H 4,93 cho tương quan HMBC với C-1’ và C-6’ chứng tỏ đây là H-2. Ngoài ra, H-2 cùng với proton oxymethine ở δ _H 3,58 cùng cho tương quan với một carbon methylene ở δ _C 29,2. Vậy proton oxymethine này là H-3 và carbon methylene là C-4. Vị trí của các carbon trong vòng C cũng được xác nhận nhờ vào tương quan của H-3 với C-2 và H-4 với C-2/C-3. Proton H ₂ -4 cho tương quan HMBC với hai carbon thơm (δ _C 157,7 và 99,8). Đồng thời, hai proton thơm ghép cặp meta trên vòng benzene 1,2,3,5-tứ hoán [δ _H 6,03 (H-6) và 5,92 (H-8)] cùng cho tương quan HMBC với carbon thơm ở δ _C 99,8 chứng tỏ carbon này là C-4a và suy ra carbon ở δ _C 157,7 là C-5. Proton nhóm –OH (δ _H 7,94) cho tương quan với hai carbon thơm trong đó có một carbon mang oxygen [δ _C 157,7 và 95,8] nên hai carbon này lần lượt là C-7 và C-8. Vị trí của C-8a được xác nhận nhờ vào tương quan HMBC với proton H-8 (δ _H 5,92).

Trong vòng C, hai proton của nhóm methylene [δ _H 2,88 ( J = 16,6 và 4,6 Hz; H _a -4) và 2,75 ( J = 16,6 và 3,1 Hz; H _b -4)] ghép cặp với nhau với hằng số ghép lớn và ghép cặp với H-3 với hằng số ghép nhỏ nên H-3 phải ở vị trí xích đạo. Kết hợp so sánh tài liệu tham khảo 13 cho thấy khi H-2 là một mũi đơn, H-2 và H-3 ở cùng phía với nhau, phù hợp cấu hình cis trong cấu trạng nửa ghế ( Figure 2 B). Phân tích số liệu phổ kết hợp giá trị [α] > 0 và so sánh tài liệu tham khảo 14 đề nghị hợp chất 3 là (+)-epiafzelechin.

Figure 2 . ( A ) Tương quan HMBC chính trong 3 . ( B ) Hóa học lập thể của các proton trong vòng C

Hỗn hợp hai h ợ p chất 4 và 5 thu được dưới dạng bột màu vàng, +79.5 ( c 0.6, MeOH). Phổ ¹³ C NMR (acetone- d ₆ ) cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 30 carbon. Phân tích phổ ¹ H và ¹³ C NMR ( Table 1 ) cho thấy hợp chất mang hai khung flavan-3-ol tương tự như hợp chất 3 . Điểm khác biệt duy nhất ở vòng B là một vòng benzene 1,2,4-tam hoán thay vì 1,4-nhị hoán như ở 3 . Phổ HRESIMS cho mũi ion [M-H] ^- ở m/z 289,0708 (trị số tính toán cho C ₁₅ H ₁₃ O ₆ là 289,0712) ứng với công thức phân tử C ₁₅ H ₁₄ O ₆ , độ bất bão hòa là 9. Kết quả phân tích phổ NMR và HRESIMS cho thấy đây là hỗn hợp của hai flavan-3-ol thay vì là một dimer của hai flavan-3-ol. Lập luận tương tự như với hợp chất 3 , ở hợp chất thứ nhất, H-2 là mũi đôi, ghép cặp với H-3 bằng hằng số ghép cặp lớn ( J = 7.8 Hz), hai proton này có nằm ngược hướng nhau, tương ứng với cấu hình trans trong cấu trạng nửa ghế ( Figure 3 A). Ở hợp chất thứ hai, H-2 là mũi đơn và H-3 là mũi đơn rộng, hai proton này ở cùng hướng, tương ứng với cấu hình cis trong cấu trạng nửa ghế ( Figure 3 B). Từ các số liệu phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo 13 xác nhận cấu trúc hóa học của hỗn hợp là (+)-catechin ( 4 ) và (+)-epicatechin ( 5 ) hiện diện ở tỉ lệ 6:4, tính theo tích phân của proton.

Figure 3 . Hóa học lập thể của các proton trong vòng C của 4 ( A ) và 5 ( B )

Table 1 Số liệu phổ ¹ H (500 MHz), ¹³ C NMR (125 MHz) của 3−5 trong acetone- d ₆ ( J tính bằng Hz)

KẾT LUẬN

Từ cao ethyl acetate của vỏ cây xà cừ lá nhỏ, thu hái tại vườn ươm thực vật Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai, ba hợp chất là scopoletin ( 1 ), 3,4-dihydroxy benzoic acid ( 2 ), (+)-epiafzelechin ( 3 ), và một hỗn hợp gồm (+)-catechin ( 4 ) và (+)-epicatechin ( 5 ) đã được phân lập. Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định dựa vào phổ NMR, HRESIMS và so sánh với tài liệu tham khảo. Đây là lần đầu tiên các hợp chất này được phân lập từ cây xà cừ lá nhỏ, trong đó hợp chất 3 và 5 lần đầu tiên được báo cáo hiện diện trong chi Swietenia .

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh trong khuôn khổ Đề tài mã số B2023-18-08.

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

br: broad

d: doublet

dd: doublet of doublet

HMBC: Heteronuclear multiple bond correlation

HRESIMS: High resolution electrospray ionization mass spectroscopy

m: multiplet

NMR: Nuclear magnetic resonance

s: singlet

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Nhóm tác giả cam đoan không có xung đột lợi ích.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Trịnh Hoàng Dương phân lập hợp chất, phân tích dữ liệu phổ, tổng hợp tài liệu và viết bản thảo. Bùi Ngọc Dũng thu thập mẫu cây, ly trích và điều chế cao thô. Nguyễn Thị Lệ Thu xử lý, phân tích dữ liệu phổ và xác định cấu trúc hóa học. Nguyễn Diệu Liên Hoa kiểm tra cấu trúc hóa học và tư vấn quy trình thí nghiệm. Trần Thu Phương lên kế hoạch nghiên cứu, kiểm tra cấu trúc hóa học và hoàn chỉnh bản thảo.