Isolation and establishment of Physcion as a chemical reference substance from radix Polygonum multiflorum thunb.

Abstract

Polygonum multiflorum (Family: Polygonaceae) is a precious medicinal species listed in the IUCN Red Book of Vietnam and needed to be protected. Radix Polygonum multiflorum has been widely used in traditional Vietnamese and Chinese medicines and it is consequently utilised in a great demand. However, to guarantee the quality of medicinal herbs in the market, they are required to have the pharmacopoeial testing and control in general. One of methods used to achieve accurately analytical results is the use of chemical reference substances. Chemical reference substances isolated from natural sources are important materials that are used to verify the quality and trace analysis of medicinal products containing medicinal plants. In Vietnam, there have been any reference standard compounds for the quality control of Polygonum multiflorum. This paper reported the isolation of physcion from Radix Polygonum multiflorum Thunb. which was subsequently established as a reference substance. The isolation was performed using column chromatography on silica gel with different eluents. The compound purity and quality determination were validated by infrared spectroscopy (IR), ultraviolet (UV), nuclear magnetic resonance (NMR) and high-performance liquid chromatography (HPLC). In addition, the compound was evaluated for the homogeneity and assigned value to establish as the reference substance based on the standards of TCVN ISO 17034:2017, Appendix 3 of World Health Organization (WHO technical series 943:2006) and statistical methods for use in proficiency testing by inter-laboratory comparison ISO 13528:2015.

GIỚI THIỆU

Rễ hà thủ ô đỏ ( Radix Polygonum multiflorum Thunb.) được sử dụng trong các bài thuốc dân gian làm thuốc bổ, hỗ trợ phục hồi đen râu tóc, trị thần kinh suy nhược, các bệnh về thần kinh, ích huyết khỏe gân cốt 1 , 2 . Hiện nay rễ hà thủ ô đỏ đã được sử dụng rộng rãi làm dược liệu cũng như nguyên liệu đầu vào để điều chế các dạng chế phẩm phục vụ cuộc sống. Tuy nhiên, việc phân tích kiểm nghiệm đối tượng trên theo Dược điển Việt Nam V còn gặp nhiều khó khăn, đặc biệt đối với chỉ tiêu định lượng anthraquinone hỗn hợp có sử dụng physcion làm chất đối chiếu, nguyên nhân là do hợp chất đối chiếu này chưa được thiết lập ở Việt Nam dẫn đến phải nhập từ nước ngoài với chi phí cao và thời gian vận chuyển dài. Từ nhu cầu thực tế cho thấy việc sản xuất hợp chất đối chiếu physcion để phục vụ nhu cầu kiểm nghiệm trong nước là rất cần thiết. Nghiên cứu trước đây cho biết rễ hà thủ ô đỏ chứa physcion với hàm lượng 0,05‒0,34 g trên 1 kg mẫu khô 3 , phù hợp để hợp chất này được lựa chọn phân lập với số lượng lớn và thiết lập làm chất đối chiếu. Các yếu tố nêu trên chính là tiền đề để nghiên cứu phân lập physcion từ rễ hà thủ ô đỏ và thiết lập làm hợp chất đối chiếu được thực hiện, phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Đối tượng nghiên cứu

Rễ hà thủ ô đỏ do Công ty cổ phần Dược phẩm OPC cung cấp vào tháng 8/2019, có phiếu phân tích chứng nhận đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V 4 .

Hóa chất

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản silica gel F ₂₅₄ (Merck), các cấu tử trên bản mỏng được phát hiện bằng đèn tử ngoại. Sắc ký cột (SKC) sử dụng silica gel (60-200 μm, Merck). Dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích hoặc HPLC tùy điều kiện sử dụng: acetone, ethyl acetate, ethanol, methanol. Hóa chất đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích: phosphoric acid.

Thiết bị

Bể siêu âm M5800-E (Branson, Mỹ); Máy quang phổ hồng ngoại IS50 (Thermo, Mỹ); Máy quang phổ tử ngoại UV 2700 (Shimadzu, Nhật Bản); Máy NMR Avance II 400 MHz (Brucker, Mỹ); Tủ sấy FDL 115 (Binder, Đức); Lò nung ELF 1/14 (Carbolite, Anh); Máy chuẩn độ Karl Fischer T90 (Mettler Toledo, Thụy Sỹ); Máy HPLC CBM 20A (Shimadzu, Nhật Bản); Máy HPLC 1260 (Agilent, Mỹ); Máy HPLC Alliance system (Water, Mỹ).

Phương pháp chiết xuất và phân lập

Rễ hà thủ ô đỏ khô (20 kg) được xay thành bột và ngâm với ethanol 96% (30 L, 1 tuần 3). Gom các phần dịch chiết lại, cô quay mỗi lần 0,5 L đến khi không còn giọt dung môi hữu cơ ngưng tụ trong bình hứng. Gom các dịch sau cô quay lại và đun cách thủy bay hơi dung môi thu được cao thô ethanol (1 kg). Cao thô được phân tán hoàn toàn vào nước (1 L), rồi chiết lỏng-lỏng với ethyl acetate (2 L) cho đến khi pha hữu cơ mất màu thì dừng lại. Dịch chiết ethyl acetate được thu hồi dung môi dưới áp suất kém, thu được cao ethyl acetate (256,7 g).

Sắc ký cột cao ethyl acetate trên silica gel với hệ dung môi n -hexane : acetone có độ phân cực tăng dần (0-100%) thu được tám phân đoạn (PME1-8). Sắc ký cột phân đoạn PME3 trên silica gel bằng hệ dung môi n -hexane : chloroform (5-10%), sau đó tăng độ phân cực bằng hệ dung môi n -hexane : ethyl acetate (10-20%) thu được bảy phân đoạn (PME3.1-7). Tinh chế phân đoạn PME3.2 (638 mg) bằng cách kết tinh lại trong acetone, thu được một hợp chất tinh khiết màu vàng cam (419 mg).

Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký bản mỏng

Độ tinh khiết của sản phẩm được kiểm tra bằng cách chấm 5 µL mẫu thử [0,5 mg/ mL trong hỗn hợp methanol:chloroform (1:1, v/v )] trên bảng silica gel F ₂₅₄ với 2 hệ dung môi: n -hexane : ethyl acetate (9:1, v/v ), n -hexane:acetone (8:2, v/v ) và silica gel RP18 với hệ dung môi acetone : nước (9:1, v/v ). Hợp chất được cho là tinh khiết khi các bản mỏng sau khi giải ly, chỉ xuất hiện một vết duy nhất.

Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC

Pha động: (A) Dung dịch phosphoric acid 0,1% (10%) - (B) Methanol (90%); cột Germini C ₁₈ (25 cm x 4.6 mm; 5 µm); Đầu dò PDA với bước sóng phát hiện 265 nm; Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút; Thể tích tiêm mẫu: 10 µL.

Dung dịch thử được chuẩn bị bằng cách hòa tan 5 mg mẫu thử trong 10 mL hỗn hợp methanol : chloroform (1:1, v/v ). Dung dịch mẫu trắng là hỗn hợp methanol : chloroform (1:1, v/v ).

Tiêm lần lượt dung dịch thử và dung dịch mẫu trắng vào hệ thống sắc ký và ghi lại sắc ký đồ. Bỏ qua tất cả các pic phụ trong dung dịch thử có thời gian lưu tương ứng với các pic trong dung dịch mẫu trắng và các pic có diện tích nhỏ hơn LOQ trong phần thẩm định phương pháp khi xem sắc ký đồ ở bước sóng phát hiện của sản phẩm tinh chế. Hợp chất được cho là tinh khiết khi tỷ lệ diện tích pic chính trong sắc ký đồ dung dịch thử đạt > 95%.

Thẩm định phương pháp HPLC5

- Quy trình phân tích: thực hiện tương tự như mục "Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC”.

- Chuẩn bị các dung dịch: Dung dịch mẫu trắng: methanol : chloroform (1:1, v/v ); Dung dịch thử: Dung dịch có nồng độ hoạt chất 0,5 mg/mL trong methanol : chloroform (1:1, v/v ); Các dung dịch thử độ đặc hiệu bao gồm 5 mL dung dịch thử + 3 giọt HCl 37%, 5 mL dung dịch thử + 3 giọt H ₂ O ₂ 30%, 5 mL dung dịch thử + 3 giọt NaOH 20%. Trộn đều, để yên 60 phút; Các dung dịch thử độ tuyến tính: Sử dụng dãy dung dịch có nồng độ hoạt chất là 0,05; 0,125; 0,25; 0,50; 0,625 và 0,750 mg/mL trong methanol : chloroform (1:1, v/v ); Các dung dịch thử độ chính xác (độ lặp lại và độ tái lặp trung gian): Sử dụng dung dịch có nồng độ hoạt chất 0,5 mg/mL trong methanol : chloroform (1:1, v/v ); Các dung dịch thử độ đúng: Sử dụng dãy dung dịch có nồng độ hoạt chất là 0,05; 0,5; và 0,75 mg/mL trong methanol : chloroform (1:1, v/v ).

Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng nguyên liệu5

Gồm các chỉ tiêu: Cảm quan, định tính, mất khối lượng do làm khô, xác định tro sulfate, độ tinh khiết sắc ký.

Kiểm tra chất lượng nguyên liệu

Tiến hành kiểm tra và kết luận chất lượng nguyên liệu theo tiêu chuẩn được xây dựng nêu trên.

Thiết lập chất đối chiếu

Đóng lọ : Lượng mẫu nhất định được chia vào các lọ thủy tinh màu nâu trong môi trường khí trơ với độ ẩm < 30%RH, sau đó dập nắp kín.

Xác định độ đồng nhất của quá trình đóng lọ ISO 17034 6 : Các mẫu được lấy ngẫu nhiên từ 10 đến 30 đơn vị bằng phần mềm Excel. Việc xác định độ tinh khiết của các chất được tiến hành theo phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định, mỗi lọ được xác định 2 lần. Việc xác nhận độ đồng nhất của quá trình đóng lọ được dựa trên hướng dẫn của ISO 13528 ⁷ .

Đánh giá độ đồng nhất liên phòng thí nghiệm : Nguyên liệu sau khi đóng gói và đánh giá độ đồng nhất lọ đạt yêu cầu sẽ được lấy mẫu ngẫu nhiên và tiến hành xác định độ tinh khiết HPLC tại ba phòng thì nghiệm độc lập đạt GLP hoặc ISO/IEC 17025. Việc đánh giá đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm được thực hiện bằng phép phân tích phương sai một yếu tố ANOVA (P= 0,95) 7 .

Xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo : Việc xác định giá trị ấn định trên phiếu kiểm nghiệm phsycion và độ không đảm bảo đo được thực hiện theo hướng dẫn của ISO 13528:2005 dựa theo đánh giá kết quả của các phòng thí nghiệm 7 .

Theo quy trình thường quy và theo hướng dẫn của Dược điển Quốc tế (IP) và của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàm lượng nguyên trạng được xác định phương pháp cân bằng khối lượng (mass‒balance) theo công thức 8 , 9 : Hàm lượng nguyên trạng = Độ tinh khiết sắc ký × (100 - % tạp bay hơi - % tạp vô cơ)/100.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Xác định cấu trúc

Từ cao EtOAc của rễ hà thủ ô đỏ, đã phân lập được một hợp chất tinh khiết dạng bột màu vàng cam. Phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) cho đỉnh hấp thu cực đại tại 223, 254, 265, 286 và 433 nm. Phổ IR cho tín hiệu hấp thu đặng trưng (cm ^-1 ) tại 1674 (nối C=O); 1612 (nối C=C vòng). Phổ ¹ H NMR và ¹³ C NMR ( Table 1 ) cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với sự hiện diện của hai hydroxy kiềm nối [δ _H 12,31 (1H; s; 8-OH) và 12,12 (1H; s; 1-OH)]; hai vòng benzene 1,2,3,5-tứ hoán [δ 7,61 (1H; d; 1,1 Hz; H-4); 7,35 (1H; d; 2,5 Hz; H-5); 7,07 (1H; dd; 1,7 và 0,9; H-2); 6,68 (1H; d; 2,6 Hz; H-7)] và [δ _C 166,7 (s; C-8); 165,3 (s; C-1); 162,6 (s; C-6); 148,6 (s; C-3); 135,4 (s; C-10a); 133,4 (s; C-4a); 113,8 (s; C-9a); 110,4 (s; C-8a); 124,6 (d; C-4); 121,4 (d; C-2); 108,3 (d; C-5); 106,7 (d; C-7)], Ngoài ra còn có tín hiệu của một nhóm methoxy [δ _H 3,95 (3H; s; 6-OCH ₃ ) và δ _C 56,2 (q; 6-OCH ₃ )] và một nhóm methyl [δ _H 2,46 (3H; s; C-11) và δ _C 22,3 (q; C-11)]. Các số liệu phổ trên cho phép dự đoán đây là một anthraquinone, có công thức phân tử là C ₁₆ H ₁₂ O ₅ và độ bất bão hòa là 11. Kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo 10 cho thấy hợp chất này là physcion (hay 1,8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthraquinone) ( Figure 1 ).

Figure 1 . Cấu trúc hóa học của physcion

Table 1 Số liệu phổ ¹ H (400 MHz) và ¹³ C-NMR (100 MHz) của physcion trong CDCl ₃ ( J tính bằng Hz)

Xác định độ tinh khiết

Sắc ký bản mỏng : Tất cả các hệ dung dịch thử đều cho 1 vết duy nhất trên bản mỏng.

HPLC : Xác định được độ tinh khiết của sản phẩm > 95,0% ( Figure 2 ).

Figure 2 . Kết quả thử độ tinh khiết của sản phẩm với phương pháp HPLC. Trong đó: ( A ) Sắc ký đồ dung dịch thử, ( B ) Phổ PDA của pic chính, ( C ) Độ tinh khiết của pic chính, ( D ) Phổ 3D của dung dịch thử.

Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng

Thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc ký

Tính tương thích hệ thống: Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch thử. Kết quả thu được pic physcion có thời gian lưu khoảng 13,6 phút; số đĩa lý thuyết N= 5900; hệ số đối xứng t= 1,1; độ lệch chuẩn thời gian lưu RSD= 0,3%; độ lệch chuẩn diện tích pic RSD= 0,1%.

Độ đặc hiệu : Kết quả phân tích độ đặc hiệu được trình bày trong Figure 3 cho thấy mẫu trắng không có pic trùng với pic physcion của dung dịch thử, pic physcion trong dung dịch thử có độ tinh khiết pic = 1,000. Các pic phụ trong dung dịch thử và các dung dịch phân hủy tách hẳn ra khỏi pic chính.

Figure 3 . Kết quả thử độ đặc hiệu của phương pháp. 1:Mẫu trắng 2: Mẫu thử 3: Mẫu thử và H ₂ O ₂ 4: Mẫu thử và HCl 5: Mẫu thử và NaOH.

Độ tuyến tính: Tiến hành sắc ký dãy dung dịch thử độ tuyến tính. Kết quả thu được ( Figure 4 ) phương trình hồi quy: ŷ = 67830392x, hệ số tương quan: R = 0,9999 cho thấy có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ physcion và diện tích pic. Từ đường hồi quy tuyến tính tính được giới hạn phát hiện của phương pháp 0,00004 mg/mL (0,008%), giới hạn định lượng của phương pháp 0,0001 mg/mL (0,02%) và khoảng tuyến tính của phương pháp trong nghiên cứu này là 0,0001‒0,75 mg/mL.

Figure 4 . Kết quả thử độ tuyến tính của phương pháp

Table 2 Kết quả xác định độ lặp lại và độ tái lặp trung gian

Độ chụm (bao gồm độ lặp lại, độ tái lập trung gian): Xác định độ tinh khiết sắc ký của physcion dung dịch thử, loại trừ pic của dung môi pha mẫu và các pic có diện tích nhỏ hơn giới hạn định lượng của phương pháp, kết quả được trình bày ở Table 2 . Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) độ tinh khiết sắc ký của nguyên liệu thiết lập chuẩn physcion ứng với mỗi phòng thí nghiệm (n = 6) có giá trị 0,01% < 2,0% và của cả hai phòng thí nghiệm (n = 12) là 0,07% < 3,0%.

Độ đúng : Kết quả thử độ đúng 99,7% đạt yêu cầu quy định 98,0% - 102,0% ( Table 3 ).

Table 3 Kết quả xác định độ đúng

Thông qua việc đánh giá các tiêu chí thẩm định nêu trên cho thấy phương pháp nêu trên đạt yêu cầu để áp dụng phân tích độ tinh khiết sắc ký của physcion.

Table 4 Kết quả đánh giá physcion

Tiêu chuẩn chất lượng và kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm

Tiến hành thử nghiệm theo các điều kiện được nêu trong phần phương pháp nghiên cứu thu được kết quả theo Table 4 . Kết quả cho thấy hai chất này có độ tinh khiết >95%, đủ điều kiện để thiết lập chất đối chiếu.

Thiết lập chất đối chiếu

Đóng lọ và kiểm tra độ đồng nhất

Đóng lọ theo điều kiện được nêu trong phần phương pháp nghiên cứu thu được 95 lọ physcion, mỗi lọ 5 mg. Tiến hành lấy ra 10 lọ ngẫu nhiên cho mỗi loại để đánh giá độ đồng nhất. Dữ liệu phân tích xác định độ đồng nhất lọ được trình bày trong Table 5 . Dựa vào kết quả phân tích ANOVA cho thấy các lọ đóng gói có hàm lượng không khác biệt về mặt thống kê (Fcrit ) với khoảng tin cậy 95% chứng tỏ các lọ đồng nhất do đó tiếp tục gửi các phòng thí nghiệm để đánh giá liên phòng.

Table 5 Kết quả đánh giá đồng nhất lô physcion

Đánh giá liên phòng thí nghiệm và xác nhận giá trị ấn định

Kết quả phân tích của các phòng thí nghiệm được trình bày trong Table 6 . Tiến hành phân tích ANOVA cho thấy kết quả phân tích của các phòng thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống kê với khoảng tin cậy 95%, quy trình phân tích có độ lặp lại cao, độ tinh khiết chất phân tích không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá. Tiếp tục xử lý dữ liệu thu được bằng phân tích Robustness theo hướng dẫn ISO 13528 thu được giá trị ấn định tinh khiết sắc ký của physcion là 98,8%.

Table 6 Kết quả đánh giá liên phòng thí nghiệm physcion

Hàm lượng chất đối chiếu tính trên nguyên trạng = Độ tinh khiết sắc ký × (100 - % tạp bay hơi - % tạp vô cơ). Từ đó suy ra được giá trị ấn định hàm lượng trên chế phẩm nguyên trạng của physcion là 98,7%. Độ không đảm bảo đo U (k=2) = 0,1% (P=95%).

KẾT LUẬN

Từ cao ethyl acetate của rễ hà thủ ô đỏ, hợp chất physcion đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết của physcion, xây dựng tiêu chuẩn để xác định chất lượng nguyên liệu đã được thực hiện, đồng thời áp dụng phương pháp đã xây dựng vào việc đánh giá chất lượng các nguyên liệu liên quan. Bài báo trình bày việc đã thiết lập thành công hợp chất đối chiếu hóa học physcion nhằm phục vụ việc kiểm nghiệm chất lượng các sản phẩm có chứa rễ hà thủ ô đỏ được lưu hành ở Việt Nam.

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

d: Mũi đôi - doublet

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao - High performance liquid chromatography

IP: Dược điển Quốc tế - International pharmacopoeia

IR: Quang phổ hồng ngoại - Infrared

LOD: Giới hạn phát hiện - Limit of detection

LOQ: Giới hạn định lượng - Limit of quantity

NMR: Cộng hưởng từ hạt nhân - Nuclear magnetic resonance

PDA: Đầu dò dãy diode quang - Photodiode array detection

RSD: Độ lệch chuẩn - Relative standard deviation

s: Mũi đơn - singlet

UV: Quang phổ tử ngoại - Ultraviolet

TGA: Phân tích nhiệt trọng lượng - Thermogravimetric analysis

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Nhóm tác giả cam đoan không có xung đột lợi ích.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Tác giả Trịnh Hoàng Dương tiến hành thiết kế thí nghiệm, thu thập số liệu, xử lý kết quả và viết bản thảo.

Các tác giả Trương Tấn Sang, Hứa Gia Chi Bảo phân lập hợp chất, thực hiện thí nghiệm.

Tác giả Trần Thu Phương đưa ý tưởng, lên kế hoạch nghiên cứu và hoàn chỉnh nội dung bản thảo.