Open Access 
Abstract
The genus Usnea of the family Parmeliaceae, a genus of mainly light gray-green fruticose lichens that grow like mini shrubs without leaves or tendrils anchored on bark or branches, with about 350 known species growing in European boreal forests, but they are most commonly found in tropical and subtropical regions. In the traditional Chinese medicine, the lichen Usnea aciculifera is used to treat bladder infections, painful urination, urinary retention, and swollen kidneys. In Vietnam, there are still few studies on the chemical constituents and the biological activity of this lichen. The chemical studies of some species of the genus Usnea showed phenolic compounds, depsides, depsidones, dibenzofurans, xanthones, triterpenoids, steroids, macrolactones, quinones, phthalides and fatty, many of these compounds show biological activities such as anti-bacterial, anti-inflammatory, enzyme -glucosidase inhibition, and inhibition of cancer cell lines. From the fraction 5 of the n-hexane extract of the lichen Usnea aciculifera (Parmeliaceae), collected at Da Lat city, Lam Dong province, six phenolic and one triterpenic compounds were isolated. The chemical structures of these compounds were elucidated by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy, ESI-MS mass spectrometry, and HR-ESI-MS high-resolution mass spectrometry. They are ethyl 2,4-dimethoxy-3,6-dimethylbenzoate (1); ethyl 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoate (2); -methyl orsellinate (3); methyl 2-hydroxy-4-methoxy-3,6-dimethylbenzoate (4); methyl haematomate (5); methyl 2,6-dihydroxy-4-methyl benzoate (6) and zeorin (7).
GIỚI THIỆU
Địa y, dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi khuẩn lam (cyanobacterium) 1 , 2 . Từ lâu đời, y học cổ truyền đã sử dụng địa y để điều trị một số bệnh như viêm họng, cảm cúm, đau dạ dày, viêm phổi, giảm đau, hạ sốt 3 . Hơn thế nữa, các hợp chất cô lập từ địa y được báo cáo thể hiện khả năng kháng khuẩn, kháng oxy hóa, chống viêm, gây độc tế bào, chống virus và có thể là nguồn cung cấp nguyên liệu tiềm năng cho ngành công nghiệp dược. Trong đó, Usnea aciculifera (Parmeliaceae) là loài địa y sợi, tại Việt Nam phân bố chủ yếu ở thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng. Thành phần hóa học và dược tính của loài địa y này chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam và trên thế giới. Trong bài báo này, sáu hợp chất phenol đơn vòng và một hợp chất triterpene đã được phân lập từ cao n -hexane và xác định cấu trúc hóa học bằng phương pháp phổ nghiệm NMR và khối phổ ESI-MS.
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
Đối tượng nghiên cứu
Địa y sợi Usnea aciculifera được thu nhận tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 6/2018. Tên của loài địa y này được định danh bởi TS. Harrie Sipman (khoa thực vật học, viện bảo tàng Berlin – Dahlem, đại học Freie of Berlin, Đức). Mẫu tiêu bản thực vật được kí hiệu SGU-005 được lưu trữ tại Phòng thí nghiệm thực hành – Khu thí nghiệm thực hành – Trường Đại học Sài Gòn. Sau khi thu hái, mẫu được rửa sạch, phơi khô, xay nhuyễn thành bột khô.
Hóa chất và thiết bị
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker Avance (500 MHz cho phổ 1 H–NMR và 125 MHz cho phổ 13 C–NMR). Phổ ESI-MS được đo trên máy Bruker microOTOF Q-II. Sắc ký cột (SKC) sử dụng silica gel 60 (0,040–0,063 mm, Merck), silica gel RP–18 (Merck) và Sephadex LH–20 (GE Healthcare). Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng silica gel F 254 , silica gel 60 RP–18 F254S (Merck), thuốc thử hiện vết là dung dịch sulfuric acid 10%, gia nhiệt. Các hóa chất sử dụng cho quá trình chiết và sắc ký là ethanol (EtOH), methanol (MeOH), n– hexane, chloroform (CHCl 3 ), ethyl acetate (EtOAc) và acetone (được cung cấp bởi hãng Chemsol).
Chiết xuất và phân lập
Bột địa y khô (1000,0 g) được trích kiệt ở nhiệt độ phòng với các dung môi lần lượt là n -hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol; phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất thấp, thu được các cao thô tương ứng là cao n -hexane (42,0 g); cao chloroform (24,0 g); cao ethyl acetate (42,0 g) và cao methanol (24,0 g). Cao n -hexane (42,0 g) được sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần từ n -hexane–EtOAc (9:1–0:10), sau đó EtOAc–MeOH (10:0–0:10), thu được bảy phân đoạn (UH1 – UH7).
Tiếp tục sắc ký cột silica gel trên phân đoạn UH5 với hệ dung môi n -hexane–EtOAc (85:15), thu được chín phân đoạn phụ (UH5.1–UH5.9). Sắc kí cột silica gel pha thường phân đoạn phụ UH5.2 với hệ dung môi n -hexane–EtOAc (85:15) phân lập được hợp chất 1 (8,2 mg). Tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường phân đoạn phụ UH5.4 với hệ dung môi n -hexane–EtOAc (8:2); sau đó sắc ký với Sephadex LH-20, phân lập được hợp chất 2 (6,1 mg) và 3 (6,3 mg). Tiến hành SKC silica gel pha thường phân đoạn phụ UH5.7 với hệ dung môi n -hexane–EtOAc (75:25), sau đó rửa tủa, phân lập được hợp chất 7 (15,0 mg). Phân đoạn UH6 được SKC silica gel pha thường với hệ dung môi n -hexane– EtOAc (8:2), thu được bốn phân đoạn phụ (UH6.1–UH6.4). Phân đoạn phụ UH6.4 được SKC silica gel pha thường với hệ dung môi giải ly n -hexane–EtOAc (75:25); sau đó sắc ký Sephadex, phân lập được hợp chất 4 (9,8 mg) và 5 (7,5 mg). Phân đoạn phụ UH6.8 được SKC silica gel pha thường với hệ dung môi n -hexane–EtOAc (7:3), sau đó sắc ký Sephadex, phân lập được hợp chất 6 (6,9 mg).
Ethyl 2,4-dimethoxy-3,6-dimethylbenzoate ( 1 ): bột vô định hình màu trắng, tan trong chloroform.
Ethyl 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoate ( 2 ): bột vô định hình màu trắng, tan trong chloroform.
-Methyl orsellinate ( 3 ): bột vô định hình màu trắng, tan trong chloroform.
Methyl 2-hydroxy-4-methoxy-3,6-dimethylbenzoate ( 4 ): bột vô định hình màu trắng, tan trong chloroform.
Methyl heamatomate ( 5 ): bột vô định hình màu vàng, tan trong chloroform.
Methyl 2,6-dihydroxy-4-methyl benzoate ( 6 ): bột vô định hình màu trắng, tan trong chloroform.
Zeorin ( 7 ): bột vô định hình màu trắng, tan trong chloroform.
Các dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR được trình bày trong các Table 1 − Table 3 .
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Từ cao n -hexane của loài địa y Usnea aciculifera (Parmeliaceae), sáu hợp chất phenol đơn vòng và một hợp chất triterpene ( Figure 1 ) đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học dựa vào các phương pháp hóa lý hiện đại.
Hợp chất 1
Phổ ESI-MS của hợp chất 1 cho mũi ion phân tử giả với m/z 237,38 [M-H] - phù hợp với công thức phân tử đề nghị là C 13 H 18 O 4 . Phổ 13 C-NMR và phổ HSQC cho thấy sự xuất hiện 13 tín hiệu của 13 carbon bao gồm một carbon carbonyl tiếp cách tại δ C 167,5 (C-7); năm carbon thơm tứ cấp tại δ C [158,7 (C-4); 155,8 (C-2); 133,9 (C-6); 121,0 (C-1); 116,0 (C-3)]; một carbon methine tại δ C 108,0 (C-5); một carbon methylene tại δ C 60,5 (C-1'); hai carbon methoxy tại δ C 55,6 (4-OCH 3 ); 61,3 (2-OCH 3 ); ba carbon methyl tại δ C [19,1 (C-9); 14,0 (C-2'); 8,5 (C-8)].
Phổ 1 H-NMR cho thấy có một proton vòng thơm tại δ H 6,66 (1H, s , H-5); hai tín hiệu của hai nhóm methoxy tại δ H [3,80 (3H, s, 4-OCH 3 ); 3,67 (3H, s, 2-OCH 3 )]; một tín hiệu của nhóm methylene tại δ H 4,29 (2H, t , H-1ʹ), ba tín hiệu của ba nhóm methyl tại δ H [2,23 (3H, s , H-9); 2,03 (3H, s , H-8); 1,30 (3H, t , H-2')].
Phổ HMBC cho thấy tương quan của proton H-5 với các carbon C-3, C-4, C-9; của proton H-9 với các carbon C-1, C-5, C-6; của proton H-8 với các carbon C-2, C-3, C-4; của proton H-1' với C-2'và C-7; của proton H-2' với C-1'. Các dữ liệu này giúp đề nghị vị trí của các nhóm thế trên vòng phenol của hợp chất 1 . So sánh với dữ liệu phổ này với báo cáo của tác giả J.A. Elix 4 hợp chất 1 được đề nghị là ethyl 2,4-dimethoxy-3,6-dimethylbenzoate.
Hợp chất 2
Phổ ESI-MS của hợp chất 2 cho mũi ion phân tử giả với m/z 211,48 [M+H] + phù hợp với công thức phân tử đề nghị là C 11 H 14 O 4 . Phổ 13 C-NMR và phổ HSQC cho thấy hợp chất 2 có sự xuất hiện 11 tín hiệu tương đồng với hợp chất 1 , tuy nhiên có ít hơn 1 hai tín hiệu của hai nhóm methoxy. Phổ 1 H-NMR cũng cho thấy một proton vòng thơm tại δ H 6,28 (1H, s , H-5); hai proton của một nhóm methylene tại δ H 4,34 (2H, t , H-1'); ba nhóm methyl tại δ H [2,39 (3H, s , H-9); 1,94 (3H, s , H-8); 1,33 (3H, t , H-2')]; hai tín hiệu của hai nhóm hydroxy kiềm nối tại δ H [11,73 (1H, s, 2-OH) và 10,08 (1H, s , 4-OH)].
Phổ HMBC cho thấy tương quan của proton H-5 với các carbon C-3, C-4, C-9; của proton H-9 với các carbon C-1, C-5, C-6; của proton H-8 với các carbon C-2, C-3, C-4; của proton H-1' với C-2' và C-7; của proton H-2' với C-1'; của proton 2-OH với các carbon C-1, C-2, C-3; của proton 4-OH với các carbon C-3, C-4, C-5. Các dữ liệu này giúp đề nghị vị trí của các nhóm thế trên vòng phenol của hợp chất 2 . So sánh với dữ liệu phổ trên báo cáo của tác giả S. Schleich 5 hợp chất 2 được đề nghị là ethyl 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoate.
Hợp chất 3
Phổ ESI-MS của hợp chất 3 cho mũi ion phân tử giả với m/z 195,48 [M-H] - phù hợp với công thức phân tử đề nghị là C 10 H 12 O 4 . So sánh dữ liệu phổ 1 H-NMR ( Table 1 ) và phổ 13 C-NMR ( Table 2 ) của hợp chất 3 và hợp chất 2 cho thấy có sự tương đồng, tuy nhiên hợp chất 3 chỉ ít hơn hợp chất 2 một nhóm methylene. So sánh với dữ liệu phổ trên báo cáo của tác giả Nguyễn Thị Thu Trâm 6 hợp chất 3 được đề nghị là -methyl orsellinate.
Hợp chất 4
Phổ ESI-MS của hợp chất 4 cho mũi ion phân tử giả ở m/z 211,53 [M + H] + tương ứng với công thức phân tử C 11 H 14 O 4 . So sánh dữ liệu phổ 1 H- NMR ( Table 1 ) và phổ 13 C-NMR ( Table 2 ) của hợp chất 4 với hợp chất 3 thấy có sự tương đồng, tuy nhiên hợp chất 4 có nhiều hơn 3 một nhóm methoxy và ít hơn một nhóm hydroxy. So sánh với dữ liệu phổ trên báo cáo của tác giả U.V. Mallavadhani 7 , hợp chất 4 được đề nghị là methyl 2-hydroxy-4-methoxy-3,6-dimethylbenzoate.
Hợp chất 5
Phổ ESI-MS cho mũi ion phân tử giả ở m/z 233,32 [M + Na] + phù hợp với công thức phân tử đề nghị là C 10 H 10 O 5 . So sánh dữ liệu phổ 1 H- NMR ( Table 1 ) và phổ 13 C-NMR ( Table 2 ) của hợp chất 5 với hợp chất 3 thấy có sự tương đồng, điểm khác biệt là hợp chất 5 chứa ít hơn 3 một nhóm methyl nhưng lại có thêm một tín hiệu của nhóm formyl (-CHO) tương ứng tại δ C 193,6 và δ H 10,18 ppm. So sánh với dữ liệu phổ trên báo cáo của tác giả Dương Thúc Huy 8 hợp chất 5 được đề nghị là methyl haematomate.
Hợp chất 6
Phổ ESI-MS cho mũi ion phân tử giả ở m/z 181,0518 [M - H] - tương ứng với công thức phân tử C 9 H 10 O 4. Phổ 1 H-NMR của hợp chất 6 cho các tín hiệu cộng hưởng như sau: hai tín hiệu proton linh động của nhóm hydroxy tại 10,67 (1H, s , 2-OH); 9,96 (1H, s , 6-OH); hai tín hiệu proton thơm tại [6,17 (1H; d ; J = 2,4 Hz; H-3) và 6,15 (1H; d ; J = 2,4 Hz; H-5)] giúp xác định hai proton ở vị trí meta với nhau; một tín hiệu proton nhóm methoxy tại 3,79 (3H, s , H-8); một tín hiệu proton nhóm methyl tại 2,28 (3H, s , H-9).
Phổ 13 C-NMR của hợp chất 6 cho các tín hiệu cộng hưởng gồm một carbon carbonyl tại 171,4 (C-7); sáu carbon thơm tại [100,4 (C-1); 107,5 (C-5); 110,2 (C-3); 140,7 (C-4); 161,0 (C-2 và C-6)]; một carbon methoxy tại 51,7 (C-8) và một carbon methyl tại 22,0 (C-9). So sánh với dữ liệu phổ trên báo cáo của tác giả V.B. Tatipamula 9 hợp chất 6 được xác định là methyl 2,6-dihydroxy-4-methyl benzoate.
Hợp chất 7
Khối phổ HR-ESI-MS cho mũi ion phân tử giả ở m/z 445,4010 [M+H] + tương ứng với công thức phân tử C 30 H 52 O 2 (giá trị tính toán lý thuyết là 445,4046). Phổ 1 H-NMR của hợp chất 7 ( Table 3 ) cho thấy có tám tín hiệu proton nhóm methyl tại [0,71 (3H, s , H-28); 0,81 (3H, s , H-25); 0,92 (3H, s , H-27); 0,94 (3H, s , H-24); 0,98 (3H, s , H-26); 1,03 (3H, s , H-29); 1,07 (3H, s , H-30); 1,12 (3H, s , H-23)]; hai proton nhóm hydroxyl tại [3,88 (1H; d ; J =6,6 Hz; 6-OH); 3,81 (1H, s , 22-OH)]; một proton methine tại δ H 2,09 (1H; m ; H-21). Ngoài ra, phổ 1 H-NMR còn xuất hiện một tín hiệu proton methine hydroxyl (>CHO H ) tại δ H 3,75 (1H; m ; H-6 β ) chỉ ra rằng proton methine này ghép spin với hai proton ở vị trí trục là H-5 [ δ H 0,72 (1H; d ; J= 10,8 Hz)]; H-7 α [ δ H 1,93 (1H; d ; J aa =13,2 Hz)] và một proton ở vị trí xích đạo H-7 β [ δ H 1,35 (1H; d ; J ae =3,5 Hz)], chứng tỏ H-6 ở vị trí trục.
Phổ 13 C-NMR ( Table 3 ) kết hợp với phổ HSQC cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 30 carbon trong đó có hai tín hiệu carbon gắn với oxygen tại δ C [71,5 (C-22); 66,6 (C-6)]; tám tín hiệu carbon nhóm methyl cộng hưởng tại δ C [15,8 (C-28); 16,8 (C-25); 16,9 (C-27); 18,1 (C-26); 21,9 (C-24); 28,9 (C-29); 30,8 (C-30); 36,6 (C-23)]; sáu tín hiệu carbon nhóm methine, giúp dự đoán hợp chất 7 là một triterpene có khung sườn 22-hydroxyhopane.
Phổ HMBC cho thấy các tương quan giữa proton H-21 với C-17, C-18, C-20, C-22 giúp đề nghị dây nhánh gắn vào C-21; thêm vào đó tương quan của proton H-23 với C-3, C-4, C-5, C-24; của proton H-24 với C-3, C-4, C-5, C-23; của proton H–25 với C-5, C-9, C-10; của proton H-26 với C-7, C-8, C-9; của proton H-27 với C-8, C-13, C-14, C-15; của proton H-28 với C-13, C-17, C-18, C-19; của proton H-29 với C-21, C-22, C-30 và của proton H-30 của với C-21, C-22, C-29 giúp đề nghị hợp chất 7 có khung sườn hopane.
So sánh dữ liệu phổ trên báo cáo của tác giả Nguyễn Thị Mỹ Dung và cộng sự 10 , cùng với tham khảo về cấu hình các vị trí proton trong hợp chất 11 , hợp chất 7 được xác định là hopane-6 α ,22-diol hay còn có tên gọi thông thường là zeorin.
KẾT LUẬN
Từ cao n -hexane của loài địa y Usnea aciculifera (Parmeliaceae), sáu hợp chất phenol đơn vòng và một hợp chất triterpene đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, bao gồm ethyl 2,4-dimethoxy-3,6-dimethylbenzoate ( 1 ); ethyl 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoate ( 2 ); -methyl orsellinate ( 3 ); methyl 2-hydroxy-4-methoxy-3,6-dimethylbenzoate ( 4 ); methyl heamatomate ( 5 ); methyl 2,6-dihydroxy-4-methyl benzoate ( 6 ) và zeorin ( 7 ).
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ESI-MS: Electrospray ionization-Mass spectrometry
1 H-NMR: Proton nuclear magnetic resonance
13 C-NMR: Carbon-13 nuclear magnetic resonance
HSQC: Heteronuclear single quantum coherence
HMBC: Heteronuclear multiple bond correlation
s : singlet
d : doublet
m : multiple
t : triplet
SKC: sắc kí cột
XUNG ĐỘT LỢI ÍCH
Nhóm tác giả cam kết không có xung đột lợi ích cá nhân với những kết quả được báo cáo trong bài báo.
ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ
Trần Thị Kim Thơ, Nguyễn Đỗ Ngọc Phụng chiết tách và phân lập các hợp chất. Đỗ Thị Mỹ Liên xác định cấu trúc, chỉnh sửa bản thảo. Trần Hồng Ngọc Quyên chiết tách và phân lập các hợp chất, tổng hợp tài liệu, viết bản thảo, hoàn thiện bản thảo. Tất cả đã đọc và chấp nhận bản thảo cuối cùng.
References
- Hale ME. The biology of lichens. London: Edward Arnold; 1983. . ;:. Google Scholar
- Nash TH. Lichen biology. Cambridge: Cambridge University Press; 1996. . ;:. Google Scholar
- Hawksworth DL. Lichen Secondary Metabolites: Bioactive Properties and Pharmaceutical Potential. Springer International Publishing; 2015. p. 277-278. . ;:. Google Scholar
- Elix JA, Norfolk S. Synthesis of para-Orcinol Depsides. Aust J Chem. 1975;28:1113-24. . ;:. Google Scholar
- Schleich S, Papaioannou M, Baniahmad A, Matusch R. Activity-Guided Isolation of an Antiandrogenic Compound of Pygeum africanum. Planta Med. 2006;72:547-551. . ;:. PubMed Google Scholar
- Nguyen TTT, Dinh HA, Huynh HT, Nguyen TT. Investigation of chemical constituents and cytotoxic activity of the lichen Usnea undulata. Vietnam J Chem. 2020;58(1):63-66. . ;:. Google Scholar
- Mallavadhani UV, Tirupathamma RS, Sagarika G, Ramakrishna S. Isolation, chemical modification and anticancer activity of major metabolites of the lichen Parmotrema mesotropum. Chem Nat Compd. 2019;55(5):825-831. . ;:. Google Scholar
- Huy DT, Chi HBL, Phong HX, Quang TT, Phung NKP. Some phenolic compounds of lichen Parmotrema planatilobatum (Hale) (Parmeliaceae). Tap chi Phat trien Khoa hoc va Cong nghe. 2011;14(T6). . ;:. Google Scholar
- Tatipamula VB, Vedula GS. Antimicrobial and anti-tubercular activities of isolates and semi-synthetic derivatives of lichen Ramalina leiodea (Nyl.). J Serb Chem Soc. 2019;84(6):555-562. . ;:. Google Scholar
- Dung NTM, Tuyen PNKT, Mortier J, Phung NKPP. Some triterpenoids and steroids from the lichen Lobaria orientalis, Lobariaceae. Tap chi Phat trien Khoa hoc va Cong nghe. 2016;54(2C):313-319. . ;:. Google Scholar
- Christie WW. Sterols: 4. Hopanoids and related lipids [Internet]. 2023 [cited 2023 Oct 08]. . ;:. Google Scholar
