Synthesis and evaluation of biological activities of two belinostat analogs bearing fluorine at the CAP

Abstract

Histone deacetylase enzymes are overexpressed in many types of hematologic malignancies (acute myelogenous leukemia, myelofibrosis, cutaneous T-cell lymphoma, and Hodgkin lymphoma) and their inhibition of HDACs could result in the inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis. Thus, HDAC inhibitors are candidates of anticancer drug development. Belinostat is a histone deacetylase inhibitor which was approved by the US FDA in 2014 for the treatment of refractory T-cell lymphoma and solid tumor. This paper reported the synthesis of two belinostat analogues (including a firstly synthesized compound) by introducing fluorine atoms at the hydrophobic capping group (CAP) of belinostat. The resulted compounds were then tested by molecular docking analysis and in vitro evaluation of their antioxidant and anti-cancer activities. The new compound 8a displayed the highest anti-cancer efficacy against human breast (MCF-7) and liver (Hep-G2) cancer cell lines with EC50 values of 1.5‒4.0 μg/mL. Two compounds showed the antioxidant activity with an EC50 value of 8.30‒13.60 μg/mL. These results suggested that the synthesized belinostat analogs might have anti-cancer potential for further investigation.

MỞ ĐẦU

Enzyme histone deacetylase (HDAC) là mục tiêu đầy hứa hẹn cho các can thiệp trị liệu, do hoạt động bất thường của enzyme HDAC có liên quan đến nhiều loại bệnh ung thư, tiểu đường và các bệnh khác ở người 1 , 2 . Trong cơ thể con người, sự cân bằng của quá trình acetyl hóa được duy trì bởi hai loại enzyme là histone acetyltransferase (HAT) và HDAC 3 . HDAC xúc tác cho quá trình deacetyl hoá nhóm ɛ - N acetyl lysine amino acid ở phần đuôi của histone, làm đóng xoắn chromatin, do đó ức chế quá trình phiên mã 4 . Sự cân bằng giữa hoạt động của HAT và HDAC là điều kiện để các tế bào hoạt động bình thường 4 . Trong các tế bào tiền ung thư, sự deacetyl hóa chiếm ưu thế dẫn đến các thay đổi, biệt hóa, tăng sinh, chết của tế bào, hay nói cách khác là biến chúng thành các tế bào ác tính. Đồng thời, sự gia tăng quá trình deacetyl cũng dẫn đến sự di chuyển mất trật tự của các tế bào và hình thành mạch máu, từ đó dẫn đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư 4 , 5 . Chính vì vậy, các hoạt chất ức chế HDAC dần trở thành các tác nhân mới trong điều trị các bệnh ung thư. Belinostat là hợp chất ức chế HDAC phổ rộng, đã được FDA Hoa Kỳ chấp thuận cho điều trị u lympho tế bào T ngoại vi (một dạng bệnh ung thư về huyết học) 6 ( Figure 1 ). Ngoài ra, belinostat còn ngăn chặn sự tăng sinh các tế bào ung thư bằng cách bất hoạt con đường Wnt/β-catenin và thúc đẩy quá trình chết rụng thông qua việc điều chỉnh con đường PKC trong ung thư vú 7 .

Figure 1 . Cấu trúc của hợp chất belinostat (surface recognition domain-CAP; zinc-binding group -ZBG; connective unit-CU).

Belinostat còn được sử dụng để điều trị cho các bệnh như ung thư nội tiết thần kinh, ung thư tế bào nội tiết ở phổi, ung thư tế bào vảy ở phổi và ung thư vú... 8 , 9 . Mang hoạt tính phổ rộng và đa dạng trên nhiều loại ung thư, nên việc bào chế, thử nghiệm, tìm ra các dẫn xuất có cấu trúc sườn tương tự belinostat là việc cần thiết, góp phần bổ sung vào kho dữ liệu và làm phong phú thêm hoạt tính sẵn có của belinostat. Nhiều nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp các dẫn xuất tương tự belinostat bằng cách biến đổi phần khoá hoạt động 10 , 11 , thay đổi phần đơn vị liên kết 12 , thay đổi nhóm liên kết kim loại 10 , kết quả cho thấy có một số dẫn xuất cho hoạt tính vượt trội hơn belinostat. Bài báo trình bày việc tổng hợp một số dẫn xuất tương tự belinostat bằng cách làm thay đổi tại phần khoá hoạt động, tiếp theo các dẫn xuất được đánh giá hoạt tính in vitro trên các dòng tế bào ung thư, ngoài ra các dẫn xuất cũng đã được nghiên cứu tiếp cận mô hình gắn kết trên enzyme HDAC1.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu thí nghiệm

Phổ NMR được đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 NMR Spetrometer (độ dịch chuyển hóa học δ được tính theo ppm, hằng số tương tác J tính bằng Hz) tại Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam, máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 400 NMR tại Hàn Quốc và Bruker 300 NMR tại Đài Loan. Phổ HR-ESI-MS được đo trên máy SCIEX X500R-QTOF tại trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh. Các hóa chất và dung môi sử dụng có nguồn gốc từ Merck, Ấn Độ, Trung Quốc và Việt Nam. Sắc ký bản mỏng sử dụng bản nhôm silica gel 60 F ₂₅₄ tráng sẵn độ dày 0,2 mm (Merck). Sắc ký cột sử dụng silica gel 60 Merck (0.040‒0.063 mm).

Tổng hợp (E)-3-nitrocinnamic acid (2)

Cho malonic acid (1,04 g, 10 mmol) vào bình cầu 100 mL, thêm vào 3 mL pyridine và lắc đều. Sau đó thêm tiếp m -nitrobenzaldehyde (1,51 g, 10 mmol), đun hoàn lưu ở nhiệt độ 110°C, trong vòng 2 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, trung hòa acid dư bằng NaOH bão hòa, acid hóa lại bằng HCl 1 N, có kết tủa trắng mịn xuất hiện. Làm lạnh và lọc lấy kết tủa, sau đó sấy khô. Thu được sản phẩm 2 dạng bột mịn có màu trắng (1,83 g hiệu suất 95,0 %).

Dữ liệu phổ: ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO- d ₆ , δ ppm) ( J, Hz): 12,56 (s, 1H ‒COOH) 8,46 (s, 1H >CH‒) 8,19 ( d 8,0 1H >CH‒) 8,12 ( d 7,6 1H >CH‒) 7,68 ( d 16,4 1H =CH–) 7,66 ( t 8,0 1H >CH‒) 6,69 ( d 16,0 1H =CH–).

Tổng hợp methyl ( E )- 3 -nitrocinnamate (3)

Sản phẩm 2 (1,93 g, 10 mmol) và 40 mL CH ₃ OH được thêm vào bình cầu 100 mL, sau đó thêm ba giọt H ₂ SO ₄ đậm đặc. Hỗn hợp được đun hoàn lưu ở nhiệt độ 80°C. Sau 4 giờ hạ nhiệt độ xuống nhiệt độ phòng và để yên phản ứng. Sau 24 giờ, thu được kết tủa trắng, cô quay đuổi bớt dung môi, trung hòa bằng NaHCO ₃ 10%. Lọc kết tủa, rửa kết tủa với 100 mL H ₂ O thu được chất rắn 3 màu trắng (1,86 g hiệu suất 90,0 %).

Dữ liệu phổ: ¹ H-NMR (300 MHz, CDCl ₃ , δ ppm) ( J, Hz): 8,37 ( d 1,8 1H >CH‒) t 7,95 1H >CH‒) 6,55 ( d 15,9 1H =CH‒) 3,83 ( 3H ‒OCH ₃ ).

Tổng hợp methyl ( E )- 3 -aminocinnamate (4)

Hoà tan 3 (2,07 g, 10 mmol) và SnCl ₂ .2H ₂ O (7,9 g, 35 mmol) vào 300 mL EtOH khan trong bình cầu 500 mL. Đun hồi lưu hỗn hợp ở nhiệt độ 90°C. Sau 3 giờ, theo dõi phản ứng bằng TLC đến khi không còn xuất hiện 3 , ngưng phản ứng, để nguội, trung hoà bằng dung dịch Na ₂ CO ₃ bão hòa, hỗn hợp được chiết với EtOAc, cô đuổi dung môi thu được sản phẩm là dạng dầu màu vàng, kết tinh sản phẩm trong hệ dung môi Hex:EtOAc = 1:2 (lạnh) thu được chất rắn màu vàng nhạt (1,66 g). Hiệu suất 93,5 %.

Dữ liệu phổ: ¹ H-NMR (300 MHz, CDCl ₃ , δ ppm), ( J, Hz): 7,60 ( d 15,9 1H =CH‒) 7,17 ( t 7,65 1H >CH‒) 6,92 ( d 7,8 1H >CH‒) 6,83‒6,81 ( m 1H >CH‒) 6,68‒6,72 ( m 1H >CH‒) 6,37 ( d 15,9 1H =CH‒) 3,79 ( 1H –CH ₃ ) 3,73 ( 2H ‒NH ₂ ).

Tổng hợp chất trung gian methyl ( E )-3-(3-chlorosulfonylphenyl)acrylate (6)

Hoà tan 4 (2,55 g, 15 mmol) trong hỗn hợp 15 mL HCl đậm đặc và 3 mL acetic acid, làm lạnh hỗn hợp trên. Sau khoảng 5 phút thêm từ từ 5 mL dung dịch NaNO ₂ 50% giữ nhiệt độ phản ứng không vượt quá 5°C, khuấy phản ứng trong 45 phút. Sản phẩm thu được là muối diazonium 5 có màu vàng nâu, sản phẩm được sử dụng trực tiếp cho bước tiếp theo. Trong một bình cầu khác, 2 mL SOCl ₂ được cho vào 0,5 mL acetic acid trong 10 mL nước ở nhiệt độ nhỏ hơn 5°C, khuấy trong 10 phút. Thêm tiếp (150 mg, 1,5 mmol) CuCl vào, khuấy đến khi dung dịch từ màu xanh nhạt chuyển sang màu xanh lục, bắt đầu thêm từ từ dung dịch muối diazonium ban đầu vào hỗn hợp. Sau 2 giờ, thấy có kết tủa vàng nâu, thu lấy kết tủa vàng sau đó hoà tan trong EtOAc và chiết với nước cất, lớp hữu cơ được rửa lại nhiều lần bằng NaHCO ₃ 5% và làm khan bằng Na ₂ SO ₄ . Cô đuổi dung môi, thu được sản phẩm ở dạng rắn màu vàng nâu ( 6 ), sản phẩm được sử dụng trực tiếp cho bước tiếp theo mà không cần tinh chế. Lưu ý nên giữ nhiệt độ của bể cô quay không vượt quá 40 °C và hạn chế tiếp xúc với không khí do sản phẩm dễ phân huỷ, hóa đen ngoài không khí sau một thời gian.

Tổng hợp các sulfonamide-cinnamate ester (7a-b)

Hợp chất rắn trung gian vàng nâu ( 6 ) phía trên được hoà tan vào 5 mL 1,4-dioxane và thêm từ từ vào hỗn hợp 4-fluoroaniline hoặc 2,4-difluoroaninline (4 mmol) trong 2 mL 1,4-dioxane và 5 mL dung dịch NaHCO ₃ bão hoà, phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ. Sau khi cô đuổi hết dung môi thêm tiếp vào 25 mL nước khuấy trong 1 giờ. Chiết sản phẩm với EtOAc và rửa dịch chiết nhiều lần với dung dịch HCl 1N. Cô đuổi dung môi, tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột silica gel, hệ dung môi hexane : EtOAc (5:1 đến 2:1). Thu được sản phẩm dạng dầu. Hoà tan sản phẩm trong EtOAc và tiến hành kết tinh lại sản phẩm nhiều lần.

Hợp chất 7a : Chất rắn màu trắng, 497 mg. Hiệu suất 9,8 %. Dữ liệu phổ: ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO- d ₆ , δ ppm) ( J, Hz): 10,22 ( 1H >NH) 7,99 ( 1H >CH–) 7,95 ( d 8,0 1H >CH–) 7,70 ( d 7,2 1H >CH–) 7,67 ( d 15,6 1H =CH–) 7,57 ( t 7,8 1H >CH–) 7,08-7,03 ( m 4H >CH–) 6,65 ( d 16,0 1H =CH–) 3,72 ( 3H –CH ₃ ).

Hợp chất 7b : Chất rắn màu trắng, 545 mg. Hiệu suất 10,3 %. Dữ liệu phổ: ¹ H-NMR (400 MHz, DMSO- d ₆ , δ ppm) ( J, Hz): 10,15 ( 1H >NH) 8,00 ( d 7,6 1H >CH–) 7,97 ( 1H >CH–) 7,69 ( d 8,0 1H >CH–) 7,69 ( d 16,0 1H =CH–) 7,25‒7,19 ( m 2H >CH–) 7,02 ( t 8,6 1H, >CH–) 6,66 ( d 16,4 1H =CH–) 3,72 ( 3H –CH ₃ ).

Tổng hợp các sulfonamide-hydroxamic acid (8a-b):

Hoà tan (784 mg, 14 mmol) KOH và (973 mg, 14 mmol) NH ₂ OH.HCl trong 4 mL EtOH khan, hỗn hợp được giữ lạnh dưới 5°C sau đó lọc phần không tan. Hỗn hợp KOH (135 mg, 2,4 mmol) và sulfonamide (0,2 mmol) trong EtOH khan, được thêm vào dịch lọc trên, tiếp tục khuấy và làm lạnh dưới 5°C. Sau 1 giờ, thêm vào 25 mL nước, trung hoà hỗn hợp bằng dung dịch HCl 2N. Tiến hành chiết nhiều lần với EtOAc, làm khan bằng MgSO ₄ , cô đuổi dung môi và tinh chế sản phẩm bằng sắc ký điều chế silica gel được tráng trên thuỷ tinh (preTLC) với hệ dung môi giải hấp Hex:EtOAc = 1:2.

Hợp chất 8a : Chất rắn màu trắng, 49 mg. Hiệu suất 73,8 %. Dữ liệu phổ: ¹ H-NMR (500 MHz, DMSO- d ₆ , δ ppm) ( J, Hz): 10,81 ( 1H –OH) 10,25 ( 1H >NH) 9,12 ( 1H >NH) 7,88 ( 1H >CH–) 7,78 ( d 7,5 1H >CH–) 7,65 ( d 7,5 1H >CH–) 7,57 ( t 7,8 1H, >CH–) 7,46 ( d 16,0 1H =CH–) 7,08 ( d 6,5 4H 4 >CH–) 6,50 ( d 16,0 1H =CH–). ¹³ C-NMR (100 MHZ, DMSO- d _6, δ ppm): 167,57 160,86 158,47 142,32 141,12 140,45 136,36 134,14 132,50 130,49 127,56 125,19 123,63 123,55 121,84 116,52 116,29 113,20 HR-MS (ESI) m/z tính toán cho C ₁₅ H ₁₃ FN ₂ O ₄ S: 336,0580; tìm thấy: 336,0582 [M] ⁺ .

Hợp chất 8b : Chất rắn màu trắng, 50 mg. Hiệu suất 72,0 %. Dữ liệu phổ: ¹ H-NMR (500 MHz, DMSO- d ₆ , δ ppm) ( J, Hz): 10,80 ( 1H –OH) 10,17 ( 1H >NH) 9,10 ( 1H, >NH), 7.85 ( , 1H, >CH–), 7.82 ( d , 7.5, 1H, >CH–), 7.64 ( d , 8.0, 1H, >CH–), 7.59 ( t , 7,8 1H >CH–) 7,48 ( d 16,0 1H =CH–) 7,25‒7,20 ( m 2H 2 >CH–) 7,06‒7,02 ( m 1H >CH–) 6,50 ( d 15,5 1H =CH–). ¹³ C-NMR (100 MHz, DMSO- d ₆ , δ ppm): 162,54 144,63 141,12 137,03 136,29 132,62 130,43 127,54 124,96 121,75 112,32 105,38 105,14 105,11 104,88 HR-MS (ESI) m/z [M+H] ⁺ tính toán cho C ₁₅ H ₁₂ F ₂ N ₂ O ₄ S: 354,0486; tìm thấy: 354,0488 [M] ⁺ .

Tổng hợp sulfonamide-cinnamate ester (7) từ phản ứng Heck

Thêm từng giọt 3-bromobenzenesulfonyl chloride 9 (50 mg, 0,2 mmol) vào dung dịch có chứa sẵn 4-fluoroaniline hoặc 2,4-difluoroaninline (0.44 mmol) và DMAP (0,5% mmol) trong toluene khan (15 mL) ở 50‒60°C trong 5 phút, phản ứng được theo dõi bởi TLC. Sau khi tác chất ban đầu biến mất (20-24 h), hỗn hợp được làm lạnh ở 0°C và sau đó dung dịch 20 mL HCl 2 N được thêm vào. Hỗn hợp được chiết bằng EtOAc, sau đó cô đuổi dung môi và kết tinh sản phẩm trong EtOH lạnh, thu được sản phẩm là tinh thể màu trắng. Sản phẩm được sử dụng trực tiếp cho quá trình tiếp theo.

Hỗn hợp gồm 10 (0,2 mmol), tri( o -tolyl)phosphine (2% mmol), palladium (II) acetate (1% mmol) và triethylamine (0.3 mmol) trong toluene khan được loại bỏ khí oxygen (4 lần bằng khí argon hay nitrogen). Hỗn hợp được đun nóng ở 45‒55°C trong 20 phút. Xúc tác palladium (0) được hình thành trong quá trình này. Sau đó, phản ứng được làm nóng đến 80‒90°C, ethyl acrylate (0,22 mmol) được thêm vào từng giọt trong 5 phút. Phản ứng được theo dõi bằng TLC đến khi xuất hiện sản phẩm. Sau đó, nhiệt độ được hạ xuống 45‒55°C và khuấy qua đêm. Sau khi tác chất ban đầu biến mất, hỗn hợp được thêm nước và làm lạnh về nhiệt độ phòng. Hỗn hợp được chiết bằng EtOAc, lớp hữu cơ được rửa bằng dung dịch NaCl bão hòa, làm khan bằng Na ₂ SO ₄ , cô đuổi dung môi và tinh chế bằng sắc ký cột, thu được sản phẩm 7 . Hiệu suất sản phẩm 7 từ hai quá trình là 72,0% ( 7a ) và 67,8% ( 7b ), hệ dung môi hexane : EtOAc (5:1‒2:1).

Mô hình docking phân tử

Các ligand được vẽ bằng GaussView và tối ưu hóa năng lượng trong Gaussian bằng hàm DFT (B3LYP/6-31g (d, p)) 13 . Cấu trúc 3D của enzyme HDAC1 (ID: 4BKX) 14 được tải về từ ngân hàng cơ sở dữ liệu protein RCSB (https://www.rcsb.org/). Tất cả các phân tử nhỏ, nước và các phối tử đồng kết tinh có trong các enzyme được xóa bằng Discovery Studio Visualizer, riêng các phân tử nước ở trong trung tâm hoạt động của các enzyme được xem xét, phân tích và giữ lại. Quá trình docking được thực hiện bằng phần mềm GOLD 5.3 15 , 16 . Vùng không gian docking được chọn ở trong khoảng 10 Å tính từ tâm của chất ức chế đồng kết tinh tại trung tâm hoạt động. Sử dụng thuật toán di truyền (GA) để gắn các phối tử linh hoạt vào các vị trí liên kết với protein được cài đặt với 100 lần chạy độc lập. Giá trị giới hạn của khoảng cách được cài đặt là 2,5 Å cho liên kết hydro và 4,0 Å cho tương tác van der Waals. Hàm tính điểm và xếp hạng sử dụng là ChemPLP. Các tham số còn lại được giữ nguyên giống với các tham số mặc định. Cấu trúc xếp hạng cao nhất của mỗi phối tử được chọn và phân tích bằng Discovery Studio.

Đánh giá hoạt tính kháng oxi hoá

Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá được thực hiện dựa trên khả năng khử gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). DPPH được pha trong ethanol với nồng độ 1 mg/mL và được bảo quản ở nhiệt độ dưới 5°C. Các hợp chất được khảo sát khả năng khử gốc tự do tại dãy nồng độ từ 1,56-100 µg/mL và được ủ với DPPH trong tủ tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo độ hấp thụ quang tại 517 nm. Quercetin được sử dụng làm đối chứng dương và ethanol được sử dụng làm đối chứng âm. Giá trị EC ₅₀ được xác định thông qua đường công phi tuyến tính của giá trị % hoạt động thu dọn gốc DPPH ^● bằng phần mềm GraphPad Prism 8.

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro

Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT. Các dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (HTB-22TM) và ung thư gan Hep-G2 (HB-8065TM) có nguồn gốc từ ATCC. Các tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO ₂ , độ ẩm 98%, nhiệt độ 37°C, vô trùng tuyệt đối) và được bổ sung chất dinh dưỡng MEME, 7-10% FBS và một số thành phần thiết yếu khác. Mẫu thử được hòa tan bằng dung môi DMSO thành các dãy nồng độ lần lượt là 1; 4; 16; 64 và 256 µg/mL. Chất đối chứng được sử dụng là Ellipticine. Khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) được xác định bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Các thí nghiệm được làm độc lập và lặp lại ba lần. Giá trị EC ₅₀ được xác định thông qua giá trị % ức chế tế bào phát triển bằng phần mềm GraphPad Prism 9. Giá trị EC ₅₀ ≤ 4,0 µg/mL được đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào.

KẾT QUẢ

Tổng hợp

Hai dẫn xuất có cấu trúc tương tự belinostat đã được tổng hợp thông qua quy trình gồm 6 bước với tác chất ban đầu là m -nitrobenzaldehyde ( Figure 2 ), quy trình thông qua phản ứng ngưng tụ Knoevenagel để tạo phần cầu nối >C=C< với sự chọn lọc đồng phân trans cao. Hiệu suất tổng hợp toàn phần của hợp chất 8a là 5,8% và 8b là 5,92%. Ngoài ra, cả hai hợp chất cũng được tổng hợp dễ dàng thông qua quy trình bao gồm 3 bước xuất phát từ tác chất ban đầu là 3-bromobenzenesulfonyl chloride. Quy trình tổng hợp sử dụng phản ứng Heck để tạo mạch >C=C< dạng trans , hiệu suất toàn phần tổng hợp cao hơn 42,7 % ( 8a ) và 39,0 % ( 8b ).

Figure 2 . Quy trình tổng hợp các dẫn xuất tương tự belinostat

Các hợp chất được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Kết quả các dữ liệu đặc trưng từ phổ proton của hai hợp chất 8a và 8b cho thấy có sự xuất hiện hai peak tín hiệu singlet tại vùng từ trường thấp, lần lượt ở 10,80‒10,81 ppm và 9,10‒9,12 ppm với cường độ tích phân bằng 1, đặc trưng cho các tín hiệu của proton nhóm hydroxamic acid (–NHOH). Hai tín hiệu doublet với cường độ tích phân bằng 1, có hằng số ghép cặp J = 16,0 Hz lần lượt ở 7,46‒7,48 ppm và 6,50 ppm, được quy kết cho hai proton alkene sp ² tại vùng cầu nối. Do chịu ảnh hưởng từ hai nhóm rút điện tử kế cận dẫn đến mật độ điện tử tại các proton này thấp và giảm chắn nên các proton này dịch chuyển về vùng từ trường thấp hơn so với các proton của các alkene thông thường, dữ liệu này cho thấy tương ứng với cấu hình E trên cấu trúc sườn của belinostat ( Figure 3 ). Ngoài ra, kết hợp với các dữ liệu từ phổ ¹³ C-NMR và HR-MS cho thấy cấu trúc của các hợp chất đã tổng hợp phù hợp với cấu trúc như đã định hướng ban đầu (xem dữ liệu phổ chi tiết tại phần Vật liệu và Phương pháp).

Figure 3 . So sánh phổ ¹ H-NMR (500 MHz) của hai dẫn xuất 8a và 8b và hợp chất belinostat

Mô hình docking phân tử trên enzyme HDAC1

Kết quả docking cho thấy hai dẫn xuất tương tác với nhiều amino acid quan trọng tại trung tâm hoạt động của enzyme HDAC1, nhóm hydroxamic acid hình thành chelate với ion Zn ²⁺ , vùng cầu nối, nhóm khoá hoạt động đều tham gia tương tác với nhiều amino acid quan trọng khác tại trung tâm hoạt động HDAC1 bằng các loại tương tác như van der Waals, alkyl, π-alkyl, π-π ( Figure 4 ).

Figure 4 . Cấu dạng liên kết của 8a (xanh), 8b (tím) tại trung tâm hoạt động của HDAC1

Vòng phenyl A tại cầu nối cho thấy tương tác với hai amino acid Phe143 và Phe198 ở gần miệng túi, các nhóm phenyl của phenylalanine định hướng song song với vòng phenyl A tạo nên các tương tác xếp chồng π‒π. Nhóm hydroxamic acid còn tham gia tương tác với Tyr296, Gly142, His171 và Cys144. Hai phenylalanine (Phe143, Phe198) và tyrosine (Tyr296) là ba yếu tố cần thiết giúp cho sự chelate giữa các hợp chất hydroxamic acid với ion kẽm được ổn định. Ngoài ra, vòng phenyl B tại phần khoá hoạt động tương tác π‒alkyl với Leu264. Nguyên tử fluorine tại vị trí para cho thấy hình thành tương tác với Arg263, nhưng nguyên tử fluorine tại vị trí ortho (trên dẫn xuất 8b ) lại không cho thấy hình thành tương tác với các amino acid xung quanh.

Khả năng kháng oxi hoá

Cả hai hợp chất 8a và 8b đều cho thấy khả năng kháng oxi hoá khá tốt với nồng độ gây ra khả năng bắt 50% gốc tự do DPPH ^● dưới 15 µg/mL ( Table 1 ). Các hợp chất được khảo sát khả năng bắt gốc tự do ở nồng độ 1,56‒100 µg/mL, tại nồng độ được khảo sát là 12,5 µg/mL, hợp chất 8a cho thấy khả năng bắt gốc DPPH ^● đạt 47,90% và 73,24% đối với hợp chất 8b . Tại nồng độ khảo sát 50 µg/mL cả hai hợp chất đều cho thấy khả năng bắt gốc tự do đạt trên 76,0%.

Table 1 Khả năng kháng oxi hoá của các hợp chất

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) và ung thư gan (Hep-G2)

Hai hợp chất 8a-b được đánh giá độc tính trên tế bào ung thư vú và ung thư gan tại các dãy nồng độ 1‒256 µg/mL bằng phương pháp MTT. Hợp chất 8a cho thấy hoạt tính tốt trên cả hai dòng tế bào ung thư Hep-G2 và MCF-7 với giá trị EC ₅₀ < 4 µg/mL, hợp chất 8b thể hiện hoạt tính yếu trên dòng tế bào ung thư gan ( Table 2 ).

Table 2 Kết quả gây độc tế bào ung thư vú và ung thư gan của các hợp chất

Trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7, hợp chất 8a cho kết quả tốt nhất với phần trăm ức chế lần lượt là 98,0%, 71,0%, 59,0%, 55,0%, 49,0% tại các nồng độ tương ứng là 256; 64; 16; 4 và 1 µg/mL ( Figure 5 ). Hợp chất 8b cho thấy hoạt tính yếu hơn gần 3,5 lần so với 8a . Trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, hợp chất 8a (EC ₅₀ = 4,0 µg/mL) cho thấy hoạt tính mạnh hơn 4 lần so với 8b (EC ₅₀ = 16,0 µg/mL). Tại nồng độ 1 µg/mL hợp chất 8a gây ra sự ức chế 42% trong khi đó hợp chất 8b là 17%.

Figure 5 . Phần trăm ức chế tế bào ung thư của 8a và 8b tại khoảng nồng độ 1‒256 µg/mL

THẢO LUẬN

Sự hiện diện của nguyên tử fluorine trong các phân tử hữu cơ có ảnh hưởng mạnh đến các đặc tính hóa lý và sinh học 17 . Vì vậy, bài báo trình bày việc đã tổng hợp hai dẫn xuất có cấu trúc tương tự belinostat có chứa các nguyên tử fluorine trong cấu trúc, với mục tiêu nhằm tìm ra các hợp chất tiềm năng cho hoạt tính sinh học cao. Đặc biệt, theo kết quả lược khảo tài liệu, hợp chất 8a là hợp chất mới, lần đầu tiên được tổng hợp (theo kết quả được tra cứu trên hệ thống SciFinder-CAS, Hoa Kỳ, ngày truy cập 09/09/2022). Các dẫn xuất được tổng hợp bằng cách thay đổi phần khoá hoạt động (nhóm phenyl) của cấu trúc sườn belinostat bằng một nhóm phenyl khác chứa fluorine tại các vị trí khác nhau. Quy trình tổng hợp dễ thực hiện bao gồm 3 đến 6 bước. Trong đó, để các hợp chất tổng hợp được có phần cầu nối là đồng phân dạng E thì phản ứng ngưng tụ Knoevenagel và Heck đã được sử dụng. Các dẫn xuất tương tự belinostat là đồng phân Z thường cho hoạt tính rất kém hoặc không mang hoạt tính 18 . Nhận thấy enzyme HDAC1 là nguyên nhân liên quan dấn đến nhiều bệnh ung thư như ung thư gan 19 , ung thư vú 20 , ung thư tuyến tiền liệt 19 , ung thư ruột kết 19 ,… nên đã mô phỏng định hướng ức chế của hai dẫn xuất tại vùng trung tâm hoạt động của HDAC1. Hai dẫn xuất đã tổng hợp được cho thấy tương tác và ổn định tại trung tâm hoạt động của HDAC1. Kết quả docking cho thấy hai dẫn xuất tham gia tương tác với tám amino acid. Cấu hình liên kết dạng xếp chồng khi hai phenylalanine (Phe143/198) liên kết tại vùng cầu nối của hai dẫn xuất, góp phần chặn lối vào túi liên kết và ngăn các phân tử nước đi vào. Ngoài ra, trong cấu hình liên kết với HDAC1, các hợp chất còn thể hiện sự tương tác với His171, amino acid này đóng một vai trò quan trọng, vì phối trí của Zn ²⁺ được tạo bởi Asp169, His171 và Asp257. Tất cả các phối tử tương tác với Gly142, Cys144, Arg263 và Leu264. Mặc dù chưa có thông tin về vai trò của bốn amino acid này, nhưng dựa trên vị trí của chúng, có thể thấy chúng góp phần định hình thành túi có hình dạng đặc thù cho phối tử tác kích vào. Đánh giá về tiềm năng kháng oxi hoá của hai hợp chất cũng cho kết quả khá tốt, cụ thể cả hai hợp chất đều cho thấy khả năng bắt gốc tự do DPPH ^● trong các thí nghiệm in vitro với EC ₅₀ < 15 µg/mL. Kết quả đánh giá in vitro trên hai dòng tế bào ung thư vú và ung thư gan bằng phương pháp MTT cho thấy dẫn xuất 8a mang một nguyên tử fluorine tại vị trí para giúp mang lại hoạt tính mạnh trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với giá trị EC ₅₀ bằng 1,5 µg/mL. Ở dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, dẫn xuất 8a cho giá trị EC ₅₀ bằng 4.0 µg/mL. Dẫn xuất 8b, mang hai nguyên tử fluorine tại vị trí ortho và para cho thấy hoạt tính yếu trên hai dòng tế bào với giá trị EC ₅₀ lần lượt là 5,0 và 16,0 µg/mL. Kết quả cho thấy tìm năng phong phú về hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tương tự belinostat, là tiền đề để phát triển các hợp chất có hoạt tính cho điều trị ung thư sau này, đặc biệt là thay đổi các nhóm thế tại vị trí CAP.

KẾT LUẬN

Bài báo trình bày việc tổng hợp các hợp chất có cấu trúc tương tự belinostat với sự hiện diện của nguyên tử fluorine tại phần khoá hoạt động, với đối tượng nghiên cứu ban đầu là belinostat được biết đến là một hợp chất dùng điều trị ung thư với cơ chế nhắm mục tiêu là enzyme HDAC. Docking phân tử để dự đoán cơ chế tương tác của hai dẫn xuất tại trung tâm hoạt động của HDAC1 đã được sử dụng và kết quả docking cho thấy hai dẫn xuất đều tạo phối trí với ion Zn ²⁺ và tương tác với một số amino acid quan trọng. Đánh giá in vitro trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Hep-G2 cho thấy hai dẫn xuất có hoạt tính tương đối tốt. Dẫn xuất 8a cho hoạt tính tốt nhất trên cả hai dòng tế bào ung thư với các giá trị EC ₅₀ đều dưới 4 µg/mL. Tuy nhiên, cần có thêm thực nghiệm so sánh với biệt dược gốc là belinostat và tác dụng ức chế trên HDAC. Kết quả này là cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về các chất ức chế HDAC, hỗ trợ cho sự phát triển của các phân tử điều trị bệnh ung thư mạnh hơn sau này.

Lời cảm tạ

Các tác giả xin chân thành cảm ơn Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần thơ đã hỗ trợ cơ sở vật chất để chúng tôi thực hiện nghiên cứu này.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

¹ H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của ¹ H.

¹³ C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của ¹³ C.

brs: Mũi đơn bầu rộng (broad singlet)

CAP: capping group

CU: connective unit

d: Mũi đôi (doublet)

DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EtOAc: Ethyl acetate

FDA: Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

GA: Genetic Algorithm

HAT: histone acetyltransferase

HDAC: histone deacetylase

Hep-G2: dòng tế bào ung thư gan ở người

MCF-7: Dòng tế bào ung thư vú ở người

MeOH: Methanol

m: Mũi đa (multilet)

PKC: Protein kinase C

RCSB: Ngân hàng dữ liệu Protein

s: Mũi đơn (singlet)

ZBG: zinc-binding group

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả đồng ý, không có bất kỳ xung đột lợi ích nào liên quan đến các kết quả đã công bố.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Nguyễn Cường Quốc, Lê Đăng Quang, Trần Quang Đệ định hướng, lên kế hoạch, thực hiện các thí nghiệm, đánh giá, xử lý các dữ liệu, chỉnh sửa và viết bản thảo.

Đặng Huy Phúc, La Thị Kim Tú, Bùi Thị Bửu Huê, Nguyễn Trọng Tuân, Trần Thanh Mến thực hiện các thí nghiệm, hỗ trợ xử lý các dữ liệu.