Mutagenesis of Rhodosporidium toruloides using ethyl methanesulfonate for enhancing astaxanthin production and evaluation scavenging activity against 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl of astaxanthin

Abstract

Astaxanthin is a valuable carotenoid which has been approved as a food coloring by the US Food and Drug Administration. This work aimed to attain Rhodosporidium toruloides mutants for enhanced astaxanthin accumulation using ethyl methanesulfonate mutagenesis (EMS). EMS treatment was shown efficient at different investigated concentration included 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 and 6.0% in affecting the yeast for enhanced astaxanthin production. Among the screened mutants, E4 (1719.9 µg/L), an EMS-induced mutant at 3.5% concentration, exhibited the highest astaxanthin production which was significantly higher than that of the wild strain (increased 4.7 times). A mutant yeast strain E4 showed a short lag phase of about 2 hours, then 32 hours of log phase, 35 hours of stationary phase and then entered to death phase after 70 hours of inoculation. The best time to collect astaxanthin was after 96 hours of inoculation in Hansen broth, the accumulated astaxanthin content was 1719 µg/L. Crude extract of astaxanthin from mutant strain E4 had the scavenging capacity of DPPH free radicals (IC50 = 9.106 µg/mL) 10.6 times higher than that of vitamin E and their’s application direction in the pharmaceutical industry, nutritional supplements, as well as bioproduct used in the aquaculture industry.

MỞ ĐẦU

Astaxanthin (3,3´-dihydroxy- β-carotene-4,4´-dione) là một trong các sắc tố thuộc nhóm keto-carotenoid, đã được Tổ chức Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration-FDA) chấp thuận để dùng làm hợp chất tạo màu trong thực phẩm, thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản 1 . Ngoài ra, astaxanthin có hoạt tính kháng oxy hoá mạnh, chống lại tế bào ung thư, bảo vệ nơron thần kinh, giúp phòng các bệnh lý tim mạch, bảo vệ võng mạc, chống lại sự thoái hoá điểm vàng do tuổi tác, bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím, giúp làm tăng sức chịu đựng và phòng những tổn thương về cơ và xương 2 , 3 . Do vậy, astaxanthin hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm, dinh dưỡng thực phẩm chức năng và mỹ phẩm.

Nguồn thu nhận astaxanthin được cung cấp chủ yếu trong tự nhiên từ động vật giáp xác, vi khuẩn, tảo và nấm men hoặc được tổng hợp từ các hợp chất có nguồn gốc từ công nghệ hoá dầu 4 . Trong đó, quá trình tổng hợp hoá học cho sản lượng astaxanthin lớn nhưng nhược điểm là gây ô nhiễm môi trường, đáng chú ý hơn nữa là cần xem xét ở mức độ an toàn và chức năng sinh học của các loại astaxanthin tổng hợp 5 . Để giải quyết các vần đề trở ngại này, việc thu nhận astaxanthin từ nguồn tự nhiên, đặc biệt là các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin phát triển nhanh chóng. Trong các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp astaxanthin, vi tảo Haematococcus pluvialis là loài được nghiên cứu kỹ nhất do có thể tích luỹ một lượng lớn astaxanthin (1,5–5,0% trên tổng trọng lượng khô). Tuy vi tảo H. pluvialis có hàm lượng astaxanthin cao nhưng ứng dụng trên quy mô công nghiệp bị hạn chế do kỹ thuật nuôi cấy đòi hỏi chi phí cao và tế bào tăng trưởng chậm. Chính vì vậy, nỗ lực tìm kiếm đối tượng nghiên cứu mới là nấm men được xem là giải pháp tổng hợp astaxanthin ở quy mô công nghiệp hiệu quả hơn tảo lục 6 .

Rhodosporidium toruloides là loài nấm men có khả năng sử dụng cơ chất lignocellulose để lên men, đồng thời có khả năng tạo và tích tụ hàm lượng lipid cao trong sinh khối, sinh tổng hợp carotenoid, enzyme có giá trị cho ngành công nghiệp hoá dầu và dược phẩm 6 , 7 , 8 . Những năm gần đây, nấm men được xem là đối tượng thu nhận astaxanthin đầy tiềm năng do hàm lượng astaxanthin tích luỹ trên khối lượng sinh khối lớn và thời gian nuôi cấy ngắn hơn so với vi tảo. Nấm men R. toruloides được công bố là một nguồn hứa hẹn sinh tổng hợp carotenoid đầy tiềm năng do có khả năng sử dụng các nguồn carbon có giá thành thấp, nguồn cung dồi dào để sinh trưởng và tốc độ phát triển nhanh 6 , 8 . Tuy nhiên chủng R. toruloides hoang dại cho hàm lượng tích luỹ astaxanthin thấp, dẫn đến việc bị hạn chế trong ứng dụng ở quy mô công nghiệp. Do đó việc nghiên cứu tăng cường hiệu quả sinh astaxanthin của chủng R. toruloides thông qua tạo và tuyển chọn các chủng đột biến mang tính khoa học và thực tiễn cao. Đã có nhiều công bố chứng minh rằng các tác nhân đột biến hoá học có khả năng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp astaxanthin của nấm men 8 , 9 .

Trong nghiên cứu này, tác nhân ethyl methanesulfonate được sử dụng để gây đột biến trên chủng nấm men R. toruloides nhằm tăng cường sinh astaxanthin so với chủng gốc ban đầu. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu theo hướng cải biến di truyền chủng R. toruloides để tạo ra chủng đột biến dùng làm nền tảng sản xuất hợp chất khác nhau đã được tiến hành trên thế giới 8 , 9 . Tuy nhiên ở Việt Nam và trên thế giới chưa có công bố nào liên quan đến việc sử dụng tác nhân ethyl methanesulfonate để tạo ra chủng đột biến của R. toruloides có khả năng tăng cường sinh astaxanthin. Ngoài việc tạo và tuyển chọn chủng đột biến tăng cường sinh astaxanthin so với chủng gốc R. toruloides được phân lập từ tác giả Ngô Đại Nghiệp và cộng sự 10 , hoạt tính kháng oxy hoá của astaxanthin thu nhận từ chủng nấm men đột biến cũng được tiến hành thử nghiệm kiểm chứng bằng phương pháp DPPH.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu thí nghiệm

Nấm men R . toruloides chủng hoang dại được phân lập tại các tỉnh miền Đông Nam bộ, lưu giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ -80 ^o C tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh hóa, Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Các chủng nấm men được đột biến trong nghiên cứu này được sàng lọc và tuyển chọn ngẫu nhiên dựa trên màu sắc của khuẩn lạc so với màu sắc của chủng nấm men hoang dại (mẫu đối chứng). Sau khi sàng lọc, 150 chủng nấm men, thu nhận được 18 chủng (kí hiệu từ E1 đến E18) có hàm lượng astaxanthin cao hơn so với chủng hoang dại.

Môi trường dùng để lên men R . toruloides là môi trường Hansen lỏng (pH 6) chứa thành phần gồm: 50 g/L glucose, 10 g/L peptone, 3 g/L KH ₂ PO ₄ và 3 g/L MgSO ₄ . Môi trường nhân giống được tiến hành trong bình tam giác (dung tích 250 mL) chứa 100 mL môi trường Hansen bổ sung 5% tỉ lệ giống nấm men R . toruloides , nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 96 giờ.

Đột biến nấm men R. toruloides ngẫu nhiên bằng EMS

Tế bào nấm men sau khi nuôi đạt mật độ tế bào khoảng 10 ⁸ tế bào/mL được xử lý với EMS 11 . Dịch huyền phù tế bào (1 mL) được ủ với EMS ở các nồng độ khác nhau gồm 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5 và 6%, vortex nhẹ sau đó ủ lắc trong 30 phút, sau đó sinh khối tế bào được rửa lại 3 lần với nước cất để loại bỏ EMS. Dịch tế bào sau xử lý (100 µL) được cấy trang trên đĩa chứa môi trường Hansen thạch và được ủ ở nhiệt độ phòng trong tối 7 ngày. Tỉ lệ sống của tế bào sau xử lý với EMS được đếm dựa trên số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri. Tiến hành tuyển chọn những khuẩn lạc nấm men có màu sắc thay đổi so với chủng hoang dại, nuôi trên môi trường Hansen lỏng trong 4 ngày ở nhiệt độ phòng, lắc 200 vòng/ phút để xác định hàm lượng sinh khối và astaxanthin.

Xây dựng đường cong tăng trưởng và xác định thời điểm thu nhận astaxanthin thích hợp của chủng nấm men đột biến

Xây dựng tương quan tuyến tính giữa giá trị OD _610nm và mật độ tế bào log N/mL 12 . Dung dịch nuôi cấy nấm men được pha loãng thành các huyền phù có độ đục đo ở OD _610nm theo một dãy các giá trị 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0. Từ các huyền phù có độ đục như trên, pha loãng và đếm tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu. Tính mật độ tế bào (N/mL) và dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD _610nm và mật độ tế bào log N/mL.

Cấy huyền phù tế bào nấm men vào 100 mL môi trường và nuôi ở điều kiện nhiệt độ phòng, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Ly tâm thu sinh khối vào các giai đoạn tăng trưởng khác nhau (pha log, cuối pha log, đầu pha ổn định, pha ổn định và pha suy tàn). Tách chiết sắc tố từ sinh khối khô đã thu được và xác định hàm lượng astaxanthin.

Xác định tỉ lệ tế bào sống sót

Tỉ lệ tế bào nấm men R. toruloides sống sót được tính theo công thức (1):

Tỉ lệ sống sót = (Cs/Cc) x100 (1)

Trong đó Cs và Cc tương ứng là tổng số tế bào đếm được sau khi xử lý với tác nhân gây đột biến và mẫu đối chứng (mẫu không xử lý với tác nhân gây đột biến) 13

Xác định khối lượng sinh khối

Các chủng nấm men đã đột biến được nuôi cấy trong erlen chứa 100 mL môi trường Hansen lỏng được lắc 200 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng trong 96 giờ. Thu sinh khối sau 96 giờ nuôi cấy bằng cách ly tâm 4000 vòng/ phút, trong 5 phút, bỏ dịch nổi. Rửa phần cặn tế bào với nước cất (lặp lại hai lần) ly tâm 4000 vòng/ phút (5 phút), thu sinh khối và sấy khô ở 60 ^o C đến khi khối lượng không đổi. Ghi nhận khối lượng sinh khối khô tính theo g/L, sinh khối này được sử dụng để xác định hàm lượng astaxathin 13 .

Tách chiết và xác định hàm lượng astaxanthin

Hàm lượng astaxanthin được xác định dựa trên phương pháp của Fang và Chang 14 An và cộng sự 15 , có sửa đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Nghiền 0,2g sinh khối khô trong 3 mL DMSO 55 ^o C, ủ 30 phút. Vortex 1 phút, ly tâm 4000 vòng/phút, trong vòng 5 phút, thu dịch nổi chứa DMSO. Thêm vào phần cặn 5 mL acetone, vortex kỹ rồi ly tâm 4000 vòng/ phút, trong 5 phút, thu dịch nổi (chiết với aceton 2-3 lần cho đến khi phần cặn hết sắc tố). Gộp tất cả dịch chiết aceton và dịch nổi chứa DMSO, thêm vào ether dầu hỏa (tỷ lệ 1:2 so với tổng dịch chiết), 10 mL nước cất, nếu không tách pha thêm 5 mL NaCl bão hòa, thu pha ether dầu hỏa phía trên chứa sắc tố. Thêm nước vào dịch chiết sắc tố (tỷ lệ 1:1), bỏ pha nước (chứa acetone và DMSO), thu dịch chiết sắc tố trong pha ether dầu hỏa (lớp phía trên). Lặp lại bước này 3–5 lần để loại bỏ hoàn toàn DMSO. Định lượng astaxanthin bằng phương pháp đo độ hấp thu của dung dịch chiết sắc tố.

Cho dịch chiết sắc tố bay hơi hoàn toàn ở nhiệt độ phòng, hòa tan sắc tố trong 10 mL ether dầu hỏa. Đo độ hấp thu của dung dịch chiết sắc tố ở bước sóng 468 nm, với mẫu đối chứng là ether dầu hỏa.

Tính hàm lượng astaxanthin (µg/g) có trong mẫu theo Kelly-Harmon (1972) 16 :

X= A ₄₆₈ * V * 10 ⁴ / (E _1cm % * G) (2)

A _468: độ hấp thu của dung dịch chiết sắc tố trong dung môi PE ở bước sóng 468; V: thể tích dung dịch chiết sắc tố (mL); E _1cm %: độ hấp thu của dung dịch astaxanthin 1% trong dung môi PE (cuvette 1cm) (E = 2100); G: trọng lượng của sinh khối nấm men (g).

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của astaxanthin bằng phương pháp DPPH

DPPH được hoà tan trong dung môi DMSO để đạt nồng độ 0,1 mM. Trong đó vitamin E được sử dụng làm chất đối chứng được pha ở dãy nồng độ là 20–100 µg/mL. Mẫu cao astaxanthin được pha loãng theo dãy nồng độ 4–20 µg/mL. Tiến hành ủ mẫu với DPPH theo tỉ lệ 4:1 trong tối 30 phút, có lắc nhẹ, sau đó đo OD ở bước sóng 517 nm 17 .

Mẫu đối chứng, astaxanthin được thay thế bằng DMSO, ngoài ra thực nghiệm thêm mẫu astaxanthin đối chứng tương ứng nồng độ mẫu ủ để loại bỏ phần sai số do màu của astaxanthin và do dung môi chứa mẫu gây ra (mẫu này không ủ với thuốc thử DPPH).

Tính phần trăm ức chế theo công thức sau, xây dựng đồ thị giữa nồng độ và phần trăm ức chế, từ đó tìm được giá trị IC ₅₀

% RSA: Phần trăm ức chế Abs control: Giá trị OD của mẫu đối chứng + giá trị OD của mẫu astaxanthin tương ứng ở các nồng độ ( không ủ với DPPH) Abs sample: Giá trị OD của mẫu đo.

Xử lý thống kê và phân tích dữ liệu

Các số liệu trong nghiên cứu đều được lặp lại ba lần và được biểu thị bởi độ lệch tiêu chuẩn (± SD - standard deviation). Phần mềm SAS phiên bản 8.2 ( SAS institute, Cary. NC, USA) được sử dụng để phân tích thống kê theo thuật toán ANOVA, Duncan test tại giá trị p <0,05.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tạo chủng đột biến tăng cường sinh astaxanthin của nấm men R. toruloides bằng EMS

Trong nghiên cứu này, chủng R. toruloides hoang dại đã bị đột biến bằng EMS và được sàng lọc để tìm chủng có hàm lượng astaxanthin cao nhất. Chủng R. toruloides hoang dại được đột biến bằng EMS với các nồng độ khác nhau và sau đó được nuôi cấy trên môi trường Hansen thạch trong 7 ngày để sàng lọc chủng có hàm lượng astaxanthin cao nhất. Sau khi được xử lý với tác nhân gây đột biến là EMS, các tế bào R. toruloides thay đổi màu sắc khuẩn lạc theo 2 hướng là tăng sắc tố hoặc giảm sắc tố. Khuẩn lạc của chủng R . toruloides hoang dại ban đầu có màu hồng cam, qua tiếp xúc với EMS đã xuất hiện những khuẩn lạc có màu đỏ hồng nổi bật, bên cạnh đó cũng có những khuẩn lạc chuyển màu nhạt dần, mất hẳn sắc tố và chỉ có màu trắng, cho thấy rằng khi xử lý đột biến với EMS có thể làm tăng hoặc giảm sự hình thành carotenoid trong R. toruloides . Khi tăng nồng độ EMS khi tiếp xúc với tế bào nấm men làm giảm tỉ lệ tế bào sống sót của R. toruloides . Kết quả từ Hình 1 cho thấy tỉ lệ sống sót của chủng nấm men R. toruloides hoang dại đã giảm đáng kể khi tăng nồng độ EMS nhưng đồng thời cũng tăng tích trữ astaxanthin trong tế bào. Kết quả này chỉ ra rằng việc sản xuất astaxanthin được tăng cường để bảo vệ các tế bào chống lại tác nhân alkyl hoá 18 .

Figure 1 . Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỉ lệ tế bào sống sót của chủng nấm men R. toruloides

Table 1 Hàm lượng sinh khối và astaxanthin của các chủng nấm men đột biến bằng EMS

EMS gây đột biến ngẫu nhiên trong vật liệu di truyền bằng cách thay thế nucleotide; đặc biệt là alkyl hóa guanine và chúng gây ra các đột biến điểm 19 , 20 . Nhóm ethyl của EMS phản ứng với guanine trong DNA, tạo lên sự bất thường điểm O6-ethylguanine. Trong quá trình sao chép DNA, các DNA polymerase xúc tác cho quá trình bắt cặp thymine, thay vì cytosine, đối diện điểm O6-ethylguanine. Sau các lần nhân đôi tiếp theo, cặp gốc G:C có thể trở thành cặp A:T (đột biến chuyển đổi) 18 , 21 . Đây là một chất đột biến mạnh được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phòng thí nghiệm trên đối tượng vi sinh vật. EMS có khả năng gây đột biến điểm trên DNA từ đó thay đổi tính trạng bên ngoài của nấm men và được di truyền qua thế hệ sau 21 . Kết quả cho thấy, tế bào nấm men R . toruloides nhạy cảm với EMS và có khả năng hình thành các chủng đột biến để thích ứng với các stress khi tiếp xúc với loại hóa chất này. Để sàng lọc chủng đột biến tăng cường sinh astaxanthin, hơn 150 tế bào đột biến đã được chọn lọc từ các đột biến ngẫu nhiên để nuôi cấy. Trong số đó, 18 chủng được tuyển chọn là có khả năng tăng cường sinh astaxanthin và những chủng này cho thấy hàm lượng sinh khối, hàm lượng astaxanthin cao hơn đáng kể so với chủng hoang dại (Bảng 1). Trong số tất cả các chủng đột biến được tuyển chọn, chủng E4 có hàm lượng astaxanthin cao nhất (1719,9 ± 88,3 µg/L). Hàm lượng astaxanthin của chủng E4 cao hơn 4,7 lần so với chủng hoang dại (Bảng 2). Hiện nay, tác nhân EMS cũng được sử dụng nhiều để gây đột biến nấm men đã được công bố trên các tạp chí quốc tế. Theo Calo và cộng sự (1995) 20 đã công bố, khi gây đột biến tế bào nấm men P . rhodozyma đã xuất hiện một số chủng đột biến có khả năng sản sinh carotenoid mà đặc biệt là astaxanthin đến 514,6 µg/g, trong khi chủng hoang dại là 357,9 µg/g; tức tăng gấp 1,5 lần. Tương tự, An và cộng sự (1989) 18 cũng đưa ra kết quả khi sử dụng EMS đột biến chủng P . rhodozyma cho hàm lượng astaxanthin cao gấp 1,5 lần chủng hoang dại (600 µg/g so với chủng ban đầu là 400 µg/g).Trong tất cả các chủng nấm men đã được đột biến EMS thì chủng E4 (khuẩn lạc thu nhận khi xử lý với EMS nồng độ 3,5%) cho khả năng tăng cường sinh astaxanthin cao nhất, do vậy chủng E4 sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo của nghiên cứu này.

Table 2 Chủng đột biến có khả năng sinh astaxanthin cao nhất ứng khi xử lý với EMS

Đường cong tăng trưởng và thời điểm thu nhận astaxanthin thích hợp của chủng đột biến E4

Đường cong sinh trưởng và hàm lượng astaxanthin thu nhận được của chủng E4 được thể hiện ở Hình 2. Chủng E4 bắt đầu pha log sau 2 giờ và sau 32 giờ nuôi cấy đi vào pha ổn định, pha ổn định kéo dài trong vòng 35 giờ và bắt đầu vào pha suy vong sau 70 giờ nuôi cấy. Chủng E4 bắt đầu tổng hợp astaxanthin sau khi kết thúc pha log, hàm lượng astaxanthin tích lũy nhiều hơn ở pha ổn định và tăng đáng kể vào pha suy vong. Thời điểm thu astaxanthin tốt nhất là sau 70 giờ tại thời điểm các tế bào nấm men đang ở gần cuối pha cân bằng và đạt cực đại là sau 96 giờ nuôi cấy lúc này sinh khối đạt giá trị cao nhất và hàm lượng astaxanthin tích lũy cao nhất đạt 1719 µg/L.

Figure 2 . Đường cong sinh trưởng và tích luỹ astaxanthin của chủng E4 theo thời gian nuôi cấy

Theo nghiên cứu của tác giả Ngô Đại Nghiệp và cộng sự (2015), chủng nấm men R . toruloides hoang dại ban đầu được sử dụng cho các thử nghiệm đột biến. Ở nghiên cứu này có số liệu về đường cong sinh trưởng như sau: pha lag trong 12 giờ đầu, pha log vào giờ thứ 12 đến giờ thứ 24, pha ổn định từ giờ thứ 26 đến giờ thứ 64 và pha suy tàn từ sau 64 giờ 12 . Chủng đã đột biến E4 cho thấy khả năng thích ứng nhanh hơn trong môi trường nuôi cấy (thời gian pha lag ngắn), thời gian pha log và pha ổn định của chủng đột biến dài hơn chủng hoang dại như vậy cho thấy khả năng sinh trưởng tốt hơn chủng hoang dại, tạo tiềm năng thu nhận được khối lượng sinh khối lớn hơn (sinh khối thu nhận của chủng E4 là 5,779 ± 0,493 g/L). Trong nghiên cứu này, chủng đã đột biến E4 cũng tích lũy astaxanthin từ cuối pha log, tăng nhanh ở pha ổn định và đạt tối đa sau 96 giờ nuôi ở pha suy tàn. Astaxanthin cũng như các chất thuộc carotenoid là nhóm hợp chất thứ cấp với vai trò bắt các gốc tự do, chống sự oxy hóa tế bào 22 , do vậy, chúng chỉ tích lũy nhiều khi quần thể tế bào bắt đầu đi vào pha cân bằng và pha suy vong, khi điều kiện môi trường dần trở nên bất lợi để bảo vệ tế bào tránh khỏi tác động từ các gốc tự do, tăng khả năng chống chịu và duy trì sự sống cho tế bào. Trong nghiên cứu của Lina và cộng sự (2015) về sự sinh trưởng của chủng nấm men X. dendrorhous hoang dại và đột biến XR4 cũng cho thấy sự sinh tổng hợp của carotenoid bắt đầu từ pha ổn định, sau đó tăng hàm lượng ở cuối pha ổn định và vào pha suy tàn trong khoảng 87 giờ nuôi cấy 23 .

Hoạt tính kháng oxy hóa của astaxanthin thu nhận từ chủng đột biến E4 theo phương pháp DPPH

Astaxanthin có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhờ vào cấu trúc phân tử đặc biệt. Trong nghiên cứu này, cao chiết thô astaxanthin của chủng nấm men hoang dại và chủng E4 sau khi thu nhận, được thực hiện khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH. DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền, khi cho các hợp chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu hợp chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH ở bước sóng 517 nm 17 .

Table 3 Giá trị IC ₅₀ của vitamin E và cao chiết thô astaxanthin

Giá trị IC ₅₀ của cao thô astaxanthin thu nhận từ chủng E4 là 9,106 ± 1,01 µg/mL thấp hơn gấp 10,6 lần so với vitamin E (IC ₅₀ = 85,91 ± 0,91 µg/mL) và không khác biệt so với cao chiết astaxanthin được thu nhận từ chủng hoang dại (9,702 ± 0,87 µg/mL) (Bảng 3). Kết quả cho thấy, astaxanthin thu nhận từ chủng đột biến vẫn giữ được hoạt tính kháng oxy hoá. Cao chiết thô astaxanthin thu nhận từ chủng nấm men đột biến R . toruloides E4 cũng thể hiện khả năng kháng oxy hóa vượt trội so với các carotenoid khác theo một số báo cáo đã công bố. Astaxanthin là 1 xanthophyll với 1 nhóm hydroxyl -OH và 1 nhóm ketone C=O trên vòng β-ionone đã làm cho hoạt tính kháng oxy hóa của astaxanthin thay đổi so với các carotenoid khác 17 , 24 . Việc đưa nhóm hydroxyl vào cấu trúc carotene, thí dụ như lutein, không dẫn đến sự thay đổi đáng kể trong hoạt tính kháng oxy hóa so với các hydrocarbon carotenoid. Tuy nhiên ở astaxanthin cho thấy sự có mặt của nhóm ketone kích hoạt nhóm hydroxyl tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển hydrogen đến các gốc peroxyl. Để giải thích hoạt tính kháng oxy hóa cao của astaxanthin so với các carotenoid khác, các nhà khoa học đã đề xuất rằng trong dung dịch astaxanthin thoát ra ở trạng thái cân bằng, phụ thuộc vào dung môi, với dạng enol của ketone dẫn đến hệ thống polyene liên hợp và ortho -dihydroxyl sở hữu một nguyên tử hydrogen có khả năng hoạt động như một tác nhân phá vỡ chuỗi phản ứng gốc tự do theo cách tương tự như nhóm hydroxyl của vitamin E 25 . Với hoạt tính kháng oxy hóa vượt trội cùng với cấu trúc đặc biệt giúp astaxanthin có thể nằm trong màng tế bào, kết quả kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH là tiền đề để thực hiện các khảo sát liên quan đến việc kháng lại các tác nhân stress, oxy hóa lipid, protein trên màng tế bào gây ra các bệnh về lão hóa.

KẾT LUẬN

Bài nghiên cứu báo cáo về các chủng đột biến của nấm men R.toruloides có khả năng tăng cường sinh astaxanthin bằng cách sử dụng tác nhân EMS. Các chủng đột biến được tạo ra tích luỹ astaxanthin lớn hơn so với chủng bố mẹ. Trong số các chủng được tuyển chọn chủng đột biến được xử lý bằng EMS nồng độ 3,5% cho hàm lượng astaxanthin cao nhất (298,17 ± 10,01 µg/g sinh khối khô và 1719,9 µg/L). Thời điểm thu nhận astaxanthin thích hợp nhất đối với chủng E4 là 96 giờ nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, 30 ^o C, tỉ lệ giống bổ sung là 5% (mật độ giống ban đầu là 10 ⁸ tế bào/mL). Cao chiết thô astaxanthin được thu nhận từ chủng đột biến E4 có khả năng bắt gốc tự do DPPH (IC ₅₀ = 9,106 µg/mL) cao gấp 10,6 lần so với vitamin E.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DMSO: Dimethyl sulfoxide

DNA: Deoxyribose Nucleic Acid

DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EMS: Ethyl methanesulfonate

NTG: N -Methyl-N′-nitro- N -nitrosoguanidine

OD: Optical density ( mật độ quang)

WT: Wild Type (loại hoang dại)

IC ₅₀ : 50% inhibitory concentration

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả đồng ý không có bất kỳ xung đột lợi ích nào liên quan đến các kết quả đã công bố.

ĐÓNG GÓP CỦA TÁC GIẢ

Trần Thị Tuyết Nhung thực hiện các thí nghiệm, thu thập, xử lý và viết bản thảo.

Ngô Đại Nghiệp đưa ra ý tưởng, chỉnh sửa bản thảo, thảo luận các kết quả nghiên cứu và hoản chỉnh bản thảo.

LỜI CÁM ƠN

Nghiên cứu được tài trợ bởi Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh (ĐHQG-HCM) trong khuôn khổ Đề tài mã số B2019-18-03.