Isolation and screening of Pseudomonas isolates enhance salinity tolerance of peanut (Arachis hypogaea L.)

Abstract

The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) is one of the most promising alternative approaches to improve plant growth under salt stress. Among PGPR, Pseudomonas is a bacterial genus that possesses a variety of mechanisms for plant-growth-promoting and induction of biotic as well as abiotic stress tolerance. In this study, we screened three potential strains and tested the growth promotion of peanut (Arachis hypogaea) under saline conditions. All three isolates (strains) showed in vitro plant growth promoting traits such as the production of indoleacetic acid (IAA), phosphate solubilization, and nitrogen fixation.  Moreover, the 3 isolates present gene encoding ACC deaminase, and an important enzyme can promote plant growth to ameliorate abiotic stresses. Peanut inoculated with the strain BT00P03 showed the increase in fresh shoot biomass in normal and saline stress conditions. Our results showed that the BT00P03 strain might be used as a biological agent for eco-friendly agricultural practices. This research is the first step to understand the microbe-plant interaction mechanism under stress and to apply these strains to agricultural practices in the future.

GIỚI THIỆU

Xâm nhiễm mặn là một yếu tố nghiêm trọng làm giảm diện tích đất canh tác nông nghiệp, hạn chế năng suất và chất lượng cây trồng. Trên thế giới có hơn 45 triệu hecta đất đang bị ảnh hưởng bởi nhiễm mặn và mỗi năm diện tích này lại tăng lên 10% - một con số thật đáng lo ngại 1 . Ở Việt Nam, tình hình đất nhiễm mặn đang ở mức báo động, do sự dâng cao của mực nước biển và hạn hán kéo dài bởi ảnh hưởng của El Nino. Đặc biệt, tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long sự ngăn dòng của các đập thủy điện thượng nguồn sông Mê Kông làm cho tình hình nhiễm mặn càng trở nên nghiêm trọng hơn. Trong các tỉnh bị ảnh hưởng bởi nhiễm mặn, thì Bến Tre được xem như là một điểm nóng về tình trạng này. Hiện trạng trên đặt ra những thách thức, không chỉ trong việc chọn giống cây trồng chịu mặn, mà còn phải cải tạo hệ sinh thái đất thông qua việc tương tác của rễ thực vật với hệ vi sinh vật trong đất nhiễm mặn 2 .

Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (Plant growth promoting rhizobacteria- PGPR) là những vi khuẩn cư trú tại vùng rễ thực vật có khả năng hỗ trợ tăng trưởng và kiểm soát các tác nhân gây bệnh ở thực vật thông qua một loạt các cơ chế khác nhau. Cơ chế kích thích tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ trong điều kiện mặn liên quan đến việc sinh tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng như indole-3-acetic acid (IAA); tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng cho cây thông qua quá trình hòa tan phosphate, cố định đạm; giúp cây duy trì cân bằng ion; sinh tổng hợp 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase; cảm ứng sự chống chịu có hệ thống (inducing systemic tolerance-IST) 3 , 4 , 5 .

Đậu phộng ( Arachis hypogaea ) – một loài cây có giá trị kinh tế cao trong nông nghiệp, được xem như là loại cây chủ lực ở các nước có nền kinh tế đang phát triển ở châu Phi và châu Á. Đậu phộng là cây khá nhạy cảm với stress mặn, vì vậy sự giảm sản lượng của cây đậu phộng trong điều kiện stress mặn là một vấn đề đáng quan tâm 5 , 6 .

Trước đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn vùng rễ và bước đầu khảo sát hiệu quả trên cây mô hình Arabidopsis 4 . Trong nghiên cứu này, nhóm tập trung vào nhóm vi khuẩn là Pseudomonas tại vùng ngập mặn Bến Tre nhằm đánh giá, chọn lọc một số vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng kích thích tăng trưởng trên đối tượng cây đậu phộng trong điều kiện stress mặn.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phân lập vi khuẩn Pseudomonas

Vi khuẩn được phân lập từ mẫu đất và rễ cây bắp ( Zea mays ), cây khoai lang ( Ipomoea batatas ), dừa cạn ( Catharanthus roseus ) và đậu phộng ( Arachis hypogaea ) được thu nhận từ vùng đất nhiễm mặn thuộc xã An Thủy, huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre. Quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng chịu mặn thực hiện theo quy trình đã báo cáo trước đó bởi nhóm nghiên cứu 4 . Huyền phù thu được từ vùng đất xung quanh rễ (S), dịch rửa siêu âm bề mặt rễ (P) và dịch ly trích rễ sau khi khử trùng bề mặt (E) được trải lên môi trường King B agar bổ sung 10% NaCl. Sau 48h ủ ở (30 ± 1) ^o C, các khuẩn lạc phát huỳnh quang dưới đèn UV bước sóng 366 nm được làm thuần và bảo quản bằng kỹ thuật đông sâu ở -70 ^o C.

Các chủng đã phân lập sau đó được xác nhận lại bằng kỹ thuật PCR nhằm phát hiện đoạn trình tự rDNA 16S chuyên biệt cho chi Pseudomonas . Vi khuẩn được tăng sinh trên môi trường Tryptone Soya Broth (TSB) khoảng 18h ở (30 ± 1) ^o C. Sử dụng bộ kit Rapid Bacteria Genomic DNA isolation (Bio Basic Inc.) để ly trích gDNA vi khuẩn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng PCR (25 μL) bao gồm 2,5 μl gDNA vi khuẩn; 2,5 μL dung dịch đệm phản ứng PCR (10X); 200 nM mỗi mồi và 1 U i-Taq ^TM DNA polymerase (iNtRON). Trình tự mồi xuôi (Psmn289: 5’ – GGTCTGAGAGGATGATCA GT– 3’) và mồi ngược (Psmn1258: 5’ – TTAGCTCCACCTCGCGGC – 3’) 7 . Chương trình nhiệt của phản ứng gồm 5 phút ở 95 ^o C; 30 chu kỳ (30 giây ở 94 ^o C, 30 giây ở 55 ^o C và 1 phút ở 72 ^o C); 10 phút ở 72 ^o C. Sản phẩm PCR (khoảng 960 bp) sau đó được phát hiện bằng điện di trên gel agarose.

Khảo sát các hoạt tính sinh học của các chủng tiềm năng

Khảo sát độ chịu mặn: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường TSB bổ sung NaCl có nồng độ từ 0 đến 24%. Kết quả được ghi nhận sau 1 – 4 ngày nuôi cấy lắc ở 150 vòng/phút, (30 ± 1) ^ο C.

Khả năng sinh IAA : Hàm lượng IAA sản sinh bởi vi khuẩn được xác định nhờ phản ứng màu với thuốc thử Salkowski cải tiến 8 . Vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở trong môi trường TSB chứa 5% NaCl, có bổ sung 0,1 g/l tryptophan. Sau 5 ngày nuôi cấy lắc ở ở 150 vòng/phút, (30 ± 1) ^ο C, thu 1ml dịch khuẩn, ly tâm loại bỏ sinh khối, bổ sung thuốc thử Salkowski cải tiến với tỷ lệ dịch khuẩn: thuốc thử là 1:2. Ủ hỗn hợp trong 1 giờ, phản ứng dương tính sẽ cho màu từ hồng nhạt đến đỏ, đo độ hấp thụ ở bước sóng 530 nm xác định hàm lượng IAA dựa vào đường chuẩn IAA.

Khả năng cố định đạm: Thu nhận sinh khối vi khuẩn, rửa nhiều lần với đệm phosphate rồi cấy lên môi trường vô đạm (Nitrogen Free Mineral Medium-MNFM), chứa 3% NaCl 9 . Ghi nhận những chủng vi khuẩn có khả năng hình thành khuẩn lạc, đổi màu môi trường sau 5 ngày nuôi cấy.

Khả năng hòa tan Phosphate: Thu nhận sinh khối vi khuẩn, huyền phù trong đệm phosphate và pha loãng tới giá trị OD _600nm = 0,1 (khoảng 10 ⁸ CFU/ml). Hút 2 µl sinh khối vi khuẩn trong nước muối sinh lý cấy thành 3 điểm trên môi trường thạch PKV 3% NaCl, ủ đĩa ở (30 ± 1) ^ο C. Quan sát sự xuất hiện của vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc và vòng phân giải sau 7 ngày nuôi cấy 10 . Chỉ số hòa tan phosphate (SI: solubilization Index) sau 7 ngày được tính theo công thức: SI= Đường kính vòng phân giải/ Đường kính khuẩn lạc

Kiểm tra sự hiện diện của gene mã hóa ACC deaminase : Phản ứng PCR (25 μL) bao gồm 2,5 μl gDNA vi khuẩn; 2,5 μL dung dịch đệm phản ứng PCR (10X), 200 nM mỗi mồi và 1 U i-Taq ^TM DNA polymerase (iNtRON). Trình tự mồi xuôi (5’ – ATG AAC CTG CAA CGA TTC – 3’) và mồi ngược (5’ – TCA GCC GTC GGA AGA T – 3’) 11 . Chương trình nhiệt của phản ứng gồm 5 phút ở 95 ^o C; 35 chu kỳ (15 giây ở 95 ^o C, 15 giây ở 58 ^o C và 75 giây ở 72 ^o C); 5 phút ở 72 ^o C. Sản phẩm PCR (khoảng 750 bp) sau đó được phát hiện bằng điện di trên gel agarose.

Khảo sát kích thích tăng trưởng đậu phộng trong điều kiện mặn của vi khuẩn

Thử nghiệm in vitro

Hạt đậu phộng được khử trùng và cho nảy mầm trên bông gòn được tẩm ướt với môi trường khoáng MS . Cây con 7 ngày tuổi được chuyển sang: môi trường khoáng MS ½ có hoặc không có bổ sung vi khuẩn; môi trường khoáng MS ½ chứa 100 mM NaCl có hoặc không có bổ sung vi khuẩn 6 . Mật độ vi khuẩn bổ sung vào môi trường đạt 10 ⁶ CFU/mL. Cây được tăng trưởng trong điều kiện quang kỳ 16 giờ sáng / 8 giờ tối; nhiệt độ phòng sáng dao động từ 23 – 27 ^o C. Ghi nhận khối lượng tươi của cây sau 4 tuần tăng trưởng.

Thử nghiệm trong chậu trồng ngoài vườn ươm

Hạt đậu phộng được khử trùng và cho nảy mầm trên bông gòn được tẩm ướt với môi trường khoáng MS ½ có hoặc không có bổ sung vi khuẩn ở mật độ 10 ⁶ CFU/mL. Sau khi hạt nảy mầm, đậu phộng được chuyển sang chậu đất: đất không xử lý mặn hoặc đất được trộn với NaCl 75 mM. Cây được tưới nước 2 lần/tuần. Ở các nghiệm thức xử lý khuẩn, huyền phù vi khuẩn được bổ sung vào nước đạt mật độ 10 ⁶ CFU/ml và tưới 2 tuần một lần. Với nghiệm thức xử lý mặn, cách 2 tuần sẽ tưới bổ sung bằng dung dịch NaCl 50 mM 5 . Sau 40 ngày gieo hạt, khối lượng tươi được ghi nhận. Điều kiện nhiệt độ (ngày: 34-38 ^o C; đêm: 29-32 ^o C) và độ ẩm tương đối 48-62 %RH trong vườn ươm được ghi nhận trong suốt quá trình thí nghiệm.

Xử lý thống kê số liệu

Tất cả các số liệu được xử lí thống kê dựa trên phần mềm Microsoft Excel 2010 và phần mềm SAS University Edition.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phân lập và nhận diện vi khuẩn

Từ các nguồn mẫu thu nhận, 12 chủng vi khuẩn bao gồm 7 chủng (BT00S01, BT00S02, BT00P03, BT00P04, BT00P05, BT00P06 và BT00P07) từ cây bắp; 2 chủng (BT01S02 và BT01P01) từ cây khoai lang; 1 chủng (BT02E01) từ cây dừa cạn và 2 chủng (BT03S02 và BT03S03) từ cây đậu phộng được phân lập. Phần lớn các chủng phân lập được là từ vùng đất xung quanh rễ (các chủng được ký hiệu bởi chữ “S”) và từ bề mặt rễ (các chủng được ký hiệu bởi chữ “P”). Chỉ có duy nhất 1 chủng BT02E01 (ký hiệu bởi chữ “E”) là nội cộng sinh bên trong rễ. Trong thực tế, Pseudomonas là chi vi khuẩn rất phổ biến trong đất và vùng rễ của thực vật, nhưng do sự đa dạng về thành phần loài cùng với hiệu quả chọn lọc tương đối thấp của môi trường King B làm hạn chế khả năng phân lập vi khuẩn mục tiêu, đặc biệt là đối với những mẫu có sự phát triển của nấm mốc trên đĩa thạch.

Để khẳng định các chủng được chọn thuộc chi Pseudomonas , phản ứng PCR đã được sử dụng để khuếch đại một đoạn trình tự rDNA 16S chuyên biệt cho Pseudomonas 7 , 12 , 13 . Kết quả thí nghiệm cho thấy, chỉ có 7/12 chủng cho kết quả dương tính trên bản điện di ( Figure 1 ). Do số lượng chủng khảo sát không lớn, nên 12 chủng được phân lập (bao gồm cả các chủng âm tính với kết quả PCR) sẽ được tiến hành đánh giá các đặc điểm thúc đẩy tăng trưởng.

Figure 1 . Phản ứng PCR phát hiện trình tự rDNA 16S chuyên biệt cho chi Pseudomonas . Từ trái qua: Thang chuẩn DNA (abm 100bp plus); 1-Đối chứng âm; 2-Đối chứng dương (Pseudomonas protegens ATCC 17386), 3-BT00S01, 4-BT00S02, 5-BT00P03, 6-BT00P04, 7-BT00P05, 8-BT00P06, 9- BT00P07, 10- BT01S02, 11- BT01P01, 12- BT02E01, 13- BT03S02, 14- BT03S03.

Đánh giá khả năng chịu mặn của vi khuẩn

Khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn được đánh giá, từ đó làm tiền đề để khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật trong điều kiện muối cao. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường chứa hàm lượng NaCl tăng dần từ 6% đến 24% (khoảng cách giữa các nồng độ là 2%). Kết quả thí nghiệm trong Table 1 cho thấy các chủng khuẩn được phân lập ở Bến Tre có khả năng tồn tại trong môi trường chứa hàm lượng muối khá cao, đặc biệt là hai chủng BT03P01 và BT02E01 có thể tăng trưởng trong môi trường chứa nồng độ NaCl lên tới 20% và 22%.

Khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn

Kết quả thí nghiệm trình bày trong Table 1 cho thấy tất cả các chủng khuẩn phân lập được đều có khả năng sản sinh IAA. Tuy nhiên, hàm lượng IAA sinh tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn sau 7 ngày nuôi cấy tương đối thấp trong khoảng 1,168 – 4,423 μg/ml 14 . Nhưng theo Bùi Trang Việt (2016) thì nồng độ IAA chỉ cần đạt từ 0,1 – 1 μg/ml đã có thể tác động lên sự phát triển của cây theo chiều hướng có lợi 15 . Nên nếu đồng nuôi cấy các chủng khuẩn với thực vật trong thời gian kéo dài thì các chủng khuẩn này vẫn cung cấp đủ lượng IAA ngoại sinh cho sự phát triển thực vật bằng cách tăng trưởng rễ thông qua kéo dài rễ và làm giảm lượng ethylene. Ba yếu tố chính ảnh hưởng đến sự sản sinh IAA của các chủng vi khuẩn vùng rễ theo Mutluru và Konada (2007) là sự khác nhau giữa các loài và chủng vi khuẩn; thời gian nuôi cấy, giai đoạn phát triển của vi khuẩn và tiền chất tổng hợp IAA 16 . Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có sự sản sinh IAA khác nhau. Một số chủng vi khuẩn nổi bật cho sự sản sinh IAA như Pseudomonas aureantiaca TSAU22, Pseudomonas extremorientalis TSAU6 và Pseudomonas extremorientalis TSAU20 đã làm tăng đáng kể sự phát triển của rễ cây lên đến 25% trong điều kiện bình thường và lên đến 52% ở nồng độ NaCl 100 mM so với cây đối chứng 17 .

Cố định đạm

Dựa vào kết quả trong Table 1 thì đa số các chủng khuẩn được phân lập đều có khả năng tăng trưởng trên môi trường MNFM, trừ chủng khuẩn BT03S02. Môi trường MNFM là một môi trường vô đạm, sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường này chứng tỏ các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng nguồn nitơ không khí cho các quá trình của tế bào. Trong môi trường MNFM có bổ sung bromophenol blue, đây là một chất chỉ thị pH, có màu vàng khi môi trường acid, màu xanh lá ở pH trung tính và chuyển sang màu xanh dương khi môi trường bazơ. Trong thí nghiệm này, môi trường chuyển từ màu xanh lá sang màu xanh dương là do vi khuẩn cố định đạm tạo ra sản phẩm NH ₄ ⁺ làm pH môi trường tăng lên. Sự cố định đạm của vi khuẩn được thực hiện theo phương trình phản ứng:

N­ ₂ + 10H ⁺ + nMgATP + 8e ^- 2NH ₄ ⁺ + H ₂ + nMgADP + nP _i 2NH ₄ ^{+ 18} .

Table 1 Kết quả khảo sát một số hoạt tính sinh hóa liên quan đến đặc tính kích thích tăng trưởng của các chủng vi khuẩn được phân lập trong điều kiện stress mặn

Chủng vi khuẩn	Nồng độ NaCl cao nhất (%)	Nồng độ IAA(μg/ml)	Chỉ số hòa tan Phosphate	Cố định đạm
BT00S01	6	4,316 ± 0,133a	+ (*)	+
BT00S02	8	3,487 ± 0,206b	1,654 ± 0,301abc	+
BT00P03	8	3,458 ± 0,114b	1,839 ± 0,350ab	+
BT00P04	10	3,049 ± 0,292c	1,108 ± 0,026e	+
BT00P05	6	3,039 ± 0,151c	+ (*)	+
BT00P06	6	4,423 ± 0,196a	+ (*)	+
BT00P07	6	3,536 ± 0,160b	+ (*)	+
BT01S02	12	1,976 ± 0,203f	1,198 ± 0,090de	+
BT01P01	10	2,610 ± 0,281d	1,453 ± 0,057cd	+
BT02E01	22	3,495 ± 0,107b	1,597 ± 0,084bc	+
BT03S02	12	2,428 ± 0,075de	1,882 ± 0,055a	-
BT03S03	12	1,470 ± 0,220g	1,623 ± 0,021abc	+

Hòa tan phosphate

Trong 12 chủng vi khuẩn phân lập, chỉ có 8 chủng xuất hiện vòng phân giải sau 7 ngày nuôi cấy ( Table 1 ). Tuy nhiên sau 7 ngày nuôi cấy, 8 chủng khuẩn chỉ xuất hiện các vòng phân giải khá nhỏ và chỉ số hòa tan dao động từ 1,108 – 1,882. Các cơ chế hòa tan phosphate bởi vi khuẩn rất đa dạng, nhưng theo Sharma và cộng sự (2013) thì có 3 cơ chế chính là sản sinh acid hữu cơ, giải phóng acid vô cơ và tổng hợp các polymer ngoại bào (Extracellular polymeric substances-EPSs) 19 .

So sánh chọn lựa các chủng vi khuẩn tiềm năng

Dựa vào kết quả về các đặc điểm kích thích tăng trưởng của các chủng khuẩn được phân lập, trong các chủng phân lập từ vùng rễ cây bắp thì BT00S02, BT00P03 và BT00P04 là có đầy đủ các đặc tính như sinh IAA, cố định đạm và hòa tan phosphate. Tuy nhiên, khi xét về kết quả nồng độ IAA và cũng như chỉ số hòa tan phosphate thì 2 chủng BT00S02 và BT00P03 có ưu thế hơn so với chủng BT00P04. Trong 6 chủng vi khuẩn được phân lập từ cây đậu phộng, cây khoai lang và cây dừa cạn, 4 chủng BT01S02, BT01P01, BT02P01 và BT03S03 có đầy đủ 3 khả năng sinh hóa là sinh IAA, cố định đạm và hòa tan phosphate. Có thể thấy, chủng BT03S03 có khả năng hòa tan phosphate cao hơn so với chủng BT02E01 nhưng sự khác nhau không quá lớn, tuy nhiên chủng BT02E01 sinh ra nồng độ IAA cao hơn hẳn so với BT03S03. Vì vậy, 3 chủng BT00S02, BT00P03 và BT02E01 được chọn lọc để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Cả 3 chủng này đều cho kết quả PCR dương tính với cặp mồi chuyên biệt cho Pseudomonas .

Các chủng Pseudomonas phân lập từ vùng rễ và các mẫu đất nông nghiệp được đánh giá tương đối an toàn với người và động vật. Mặc dù mỗi loài thực vật có hiệu ứng chọn lọc khác nhau lên độ đa dạng của quần xã vi sinh vật vùng rễ, P. fluorescens và P. putida vẫn là những loài chiếm ưu thế nhất 20 . Nhiều chế phẩm thương mại từ 2 loài này đã được ứng dụng rộng rãi. Một số trường hợp P. putida gây bệnh cho người đã được ghi nhận, tuy nhiên, số ca này là rất hiếm và hầu hết gặp ở những người suy giảm miễn dịch 21 . Một thành viên khác thuộc chi này là P. aeruginosa có tiềm năng rất lớn trong việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật và khả năng đối kháng mạnh mẽ với các tác nhân gây bệnh vùng rễ. Không giống như P. fluorescens và P. putida , một số chủng P. aeruginosa là tác nhân gây bệnh cơ hội trên người 21 . Vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong nguồn nước, đất và thậm chí là trong một số loại thực phẩm. Tuy nhiên, mức độ rủi ro gây ra bởi vi khuẩn này không lớn và chỉ được xếp vào nhóm nguy cơ an toàn sinh học cấp II. Hơn nữa, không phải tất cả các chủng thuộc loài này đều có khả năng gây bệnh liên quan đến sự vắng mặt của các gene gây bệnh trong genome. Tóm lại, các chủng PGPR thuộc chi Pseudomonas có thể ứng dụng rộng rãi trong thực hành nông nghiệp với mức độ rủi ro thấp và có khả năng kiểm soát.

Sự hiện diện gene mã hóa ACC deaminase

Nhằm xác định sự hiện diện gene mã hóa ACC deaminase trong các chủng tiềm năng, phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu cho gene này ở Pseudomonas được thực hiện theo quy trình của Sheehy và cộng sự (1991) 22 . Ngoài ra, D. Saravanakumar và R. Samiyappan (2006) đã chứng minh được cặp mồi này là một cặp mồi đặc trưng cho Pseudomonas fluorescens 23 . Kết quả điện di trên Figure 2 cho thấy sản phẩm mục tiêu khoảng 750 bp xuất hiện ở cả 3 chủng được chọn.

Figure 2 . Phát hiện gene mã hóa ACC deaminase bằng phản ứng PCR

Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng cây đậu phộng

Trong thí nghiệm này, tiềm năng của các chủng vi khuẩn trong việc hỗ trợ thực vật chống chịu với stress mặn sẽ được đánh giá trên mô hình cây nông nghiệp. So với cây bắp, chỉ nhạy cảm với stress mặn ở mức độ trung bình 24 , thì cây đậu phộng là một loại rất nhạy cảm với stress mặn 5 , 6 . Do đó, mặc dù 3 chủng được chọn có nguồn gốc từ rễ cây bắp và cây dừa cạn, nhưng trong thí nghiệm này cây đậu phộng đã được chọn làm mô hình để tiến hành các thử nghiệm đáp ứng với stress.

Thử nghiệm in vitro : Trong điều kiện thường, cây được xử lí với chủng vi khuẩn BT00P03 cho thấy sự kích thích tăng trưởng thể hiện ở sự gia tăng khối lượng tươi toàn cây (tăng 30%), khối lượng thân (tăng 37%) và khối lượng rễ (tăng 13%) so với đối chứng. Trái lại, chủng vi khuẩn BT02E01 lại cho thấy dấu hiệu ức chế lên sự phát triển của cây trong khi cây được xử lý với chủng BT00S02 lại không cho thấy sự khác biệt so cây đối chứng ( Figure 3 A và Table 2 ). Tuy nhiên, trong điều kiện stress mặn, tất cả các nghiệm thức được xử lý vi khuẩn đều cho thấy có sự gia tăng khối lượng của cây so với nghiệm thức đối chứng. Trong đó, nghiệm thức được xử lý với chủng vi khuẩn BT00P03 cho hiệu quả cao nhất ( Figure 3 B và Table 2 ). Điều này cho thấy vi khuẩn có khả năng làm giảm tác động của stress mặn lên sự tăng trưởng của cây đậu phộng.

Table 2 Tác động của vi khuẩn lên khối lượng tươi cây đậu phộng trồng trên MS ½ và MS ½ bổ sung 100 mM NaCl sau 4 tuần gieo hạt trong điều kiện in vitro .

Nghiệm thức	Khối lượng tổng (mg)		Khối lượng thân (mg)		Khối lượng rễ (mg)
	0 mM NaCl	100 mM NaCl	0 mM NaCl	100 mM NaCl	0 mM NaCl	100 mM NaCl
Đối chứng (ĐC)	2308,3b±266,0	2046,1b±300,6	1625,0b±113,4	1661,4b±266,7	683,2a±179,0	384,7b±97,4
BT00S02	2237,4b±367,5	2281,3ab±70,3	1799,6b±214,1	1789,6b±146,0	437,8b±157,3	491,7a±91,4
BT00P03	2991,3a±183,7	2629,6a±27,4	2218,6a±202,6	2011,9a±97,2	772,7a±276,7	617,7a±52,7
BT02E01	1466,0c±94,7	2463,1ab±344,8	1171,5c±139,9	1927,9b±396,9	294,5c±52,7	535,2a±55,3

Figure 3 . Hình thu hoạch cây đậu phộng trong tương tác với các chủng vi khuẩn (Trong đó, A: Điều kiện in vitro không stress; B: Điều kiện in vitro stress mặn; C: Điều kiện tự nhiên không stress; D: Điều kiện tự nhiên stress mặn)

Thử nghiệm trong chậu trồng ngoài vườn ươm: Trong điều kiện thường, các cây được xử lý với chủng BT00P03 có sự gia tăng khối lượng thân và rễ lần lượt là 54% và 278% so với cây đối chứng. Trái lại, các cây được xử lý với chủng BT00P02 và BT02E01 lại cho thấy sự giảm nhẹ về khối lượng so với cây đối chứng ( Figure 3 C và Table 3 ). Trong điều kiện stress mặn, tất cả các cây được xử lí với vi khuẩn đều có khối lượng tươi cao hơn so với cây đối chứng ( Figure 3 D và Table 3 ). Kết quả thí nghiệm cho thấy sự phù hợp giữa điều kiện thử nghiệm in vitro và điều kiện thử nghiệm trong vườn ươm. Như vậy, chủng BT00P03 không những có hiệu quả kích thích tăng trưởng cây đậu phộng trong điều kiện thường mà còn có khả năng cải thiện tăng trưởng của cây trong điều kiệns tress mặn. Trong khi đó, 2 chủng còn lại chỉ có hiệu quả tích cực trong điều kiện stress mà không cho thấy hiệu quả ứng dụng trong điều kiện thường. Từ những kết quả trên, chủng BT00P03 đã cho thấy là một chủng tiềm năng trong việc sản xuất phân bón vi sinh giúp cải thiện năng suất cây trồng kể cả trong điều kiện thường hay điều kiện stress mặn.

Table 3 Tác động của vi khuẩn lên khối lượng tươi cây đậu phộng trồng trong đất và đất bổ sung 75 mM NaCl sau 40 ngày gieo hạt

Nghiệm thức	Khối lượng tổng (mg)		Khối lượng thân (mg)		Khối lượng rễ (mg)
	0 mM NaCl	75 mM NaCl	0 mM NaCl	75 mM NaCl	0 mM NaCl	75 mM NaCl
Đối chứng (ĐC)	2682,5b± 29,2	1562,6b±215,9	2184,9b±122,4	1229,9b±117,8	555,1b±32,5	332,8b±98,4
BT00S02	2019,7c±64,5	2616,5a±523,3	1484,8c±22,1	1485,2b±213,0	534,9b±76,4	891,3a±346,5
BT00P03	5468,4a±48,3	2666,7a±310,5	3368,3a±182,4	1880,2a±214,4	2100,1a±134,6	786,5a±101,1
BT02E01	2002,7c±61,8	2194,9a±134,7	1437,4c±158,9	1441,8b±142,3	559,4b±14,4	606,1a±56,1

KẾT LUẬN

Nghiên cứu này đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas từ Bến Tre, có khả năng sống trên điều kiện mặn. Trong đó 3 chủng vi khuẩn BT00S02, BT00P03 và BT02E01 được chọn lọc dựa trên khả năng hòa tan phosphate, cố định đạm và sản sinh IAA. Chủng vi khuẩn BT00P03 có khả năng kích thích tăng trưởng cây đậu phộng cả trong điều kiện bình thường và điều kiện stress mặn, cho thấy tiềm năng của chủng này trong thực hành nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên, trước khi đưa vào ứng dụng rộng rãi hoặc thương mại hóa, chủng vi khuẩn BT00P03 cần được tiến hành đánh giá về nguy cơ gây bệnh trên người và động vật, cũng như tác động lên môi trường sinh thái. Việc định danh tới mức độ loài, tầm soát sự hiện diện của các gene gây bệnh trong bộ gene cũng như thử nghiệm trên mô hình động vật sẽ cung cấp nhưng bằng chứng xác thực về mức độ rủi ro gây ra bởi chủng này.

DANH MỤC VIẾT TẮT

ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylate

bp : base pair

ĐC : Đối chứng

EPSs : Extracellular polymeric substances

IAA : Indole-3-acetic acid

IST : inducing systemic tolerance

MNFM : Nitrogen Free Mineral Medium

PCR: Polymerase chain reaction

PGPR : Plant growth promoting rhizobacteria

OD : Optical Density

TSB : Tryptone Soya Broth

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả công bố không có sự xung đột về lợi ích.

ĐÓNG GÓP CỦA TÁC GIẢ

Chu Nguyên Thanh, Phạm Văn Nhựt Tiếng và Hoàng Thị Thanh Minh thiết kế thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm, thu thập số liệu, xử lý kết quả, tham gia viết bài. Bùi Văn Lệ cố vấn về thiết kế thí nghiệm.

Chu Nguyên Thanh và Phạm Văn Nhựt Tiếng đóng góp như nhau.

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu được tài trợ bởi Đại học Quốc gia - TP. Hồ Chí Minh trong khuôn khổ đề tài mã số C2018-18-19 và TWAS 16-142 RG/BIO/AS_I–FR3240293339.