SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL - NATURAL SCIENCES

A sub-journal of Science and Technology Development Journal from 2017

Skip to main content Skip to main navigation menu Skip to site footer

 Original Research

HTML

56

Total

13

Share

Antioxidant and hepatoprotective potentials of miliusa velutina stem bark extract






 Open Access

Downloads

Download data is not yet available.

Abstract

Miliusa velutina (MV) stem bark has various medicinal uses, but its hepatoprotective effect has not yet been studied. This study investigated the antioxidant and hepatoprotective activity of the ethanol extract of MV stem bark against carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. The ethanol extract of MV stem bark was evaluated for in vitro antioxidant activity which exhibited good antioxidant activity in terms of ferric reducing-antioxidant power assay (EC50, FRAP=4.04±0.00 µg/mL), total antioxidant capacity assay (EC50, TAC=8.73±1.08 µg/mL) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (EC50, DPPH=9.33±0.07 µg/mL) radical scavenging assay. Mice were pretreated with CCl4 (2.5 mL/kg body wight per day) in 4 consecutive weeks. After one hour taking CCl4 by oral administration, mice were treated with the ethanol stem bark extract of MV at various concentrations of 100, 200, and 400 mg/kg body weight. The MV stem bark at the dose of 400 mg/kg body weight effectively reduced the level of alanine transaminase (38±6.78 U/L) and aspartate transaminase (AST) in serum. Besides, the MV stem bark at the dose 400 mg/kg body weight reduced the malondialdehyde (3.12±1,19 nM MDA/g tissue) level, and increased the activity of reduced glutathione (896.21±22.69 nM GSH/g tissue) in liver. The observation of the microscopic cross section of liver tissue also revealed that the mice treated with stem bark extract of MV at the dose of 200 and 400 mg/kg body weight had significantly improvement in liver tissues compared to the non-treated control group. Histological analyses of the MV-treated group exhibited reducing inflammatory process and preventing liver necrosis and fibrosis. In summary, the hepatoprotective effect of MV stem bark was seemingly associated with its antioxidant activity.

MỞ ĐẦU

Gan là cơ quan thực hiện các chức năng tổng hợp protein, bài tiết các enzyme và giải độc. Tuy nhiên, chức năng gan thường bị suy yếu do hóa chất độc hại, thuốc hoặc nhiễm trùng mầm bệnh 1 . Phơi nhiễm mãn tính hoặc quá mức với các loại hóa chất tổng hợp dẫn đến xơ gan hoặc tổn thương ác tính không thể điều trị được. Trong đó, carbon tetrachloride (CCl 4 ) là một dung môi hóa học được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp có thể gây tổn thương cho gan thông qua hoạt động peroxide hóa lipid, kích hoạt các cytokine gây viêm như TNF-α và IL-6 tăng cường độc tính gan thông qua chu kỳ viêm lặp đi lặp lại 2 , 3 . Bên cạnh đó, cơ chế sinh bệnh gan cũng có liên quan đến stress oxy hóa 4 . Để bảo vệ gan cũng như hạn chế những ảnh hưởng xấu đến gan, đã có nhiều nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên có khả năng phòng ngừa và điều trị các bệnh về gan, đặc biệt là các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật. Các hợp chất flavonoid và polyphenol ở nhiều loài thực vật đã được chứng minh có khả năng kháng oxy hóa 5 . Các dịch chiết từ thực vật được xem là có hiệu quả và an toàn để phòng ngừa hoặc điều trị các rối loạn chức năng gan 6 . Việc nghiên cứu tìm ra các sản phẩm kháng oxy hóa và bảo vệ gan có nguồn gốc từ thực vật đã và đang là một trong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay.

Chi Miliusa thuộc họ Na (Annonaceae) bao gồm khoảng 50 loài được tìm thấy trong các khu rừng mưa nhiệt đới 7 . Các thành phần hóa học của chi Miliusa đã cho thấy sự hiện diện của alkaloid, flavonoid 8 , acetogenin 9 , các dẫn xuất homogentisic geranylated acid 10 , terpenoid 11 , bicyclic lactone và dimeric styrylpyrone 12 . Một số những hợp chất này đã được chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn, kháng sốt rét, kháng virus, gây độc tế bào và ức chế enzyme acetylcholinesterase 8 , 9 , 12 , 13 . Trong những loài thuộc chi Miliusa thì cây Cò Sen ( Miliusa velutina ) là một loại cây thân gỗ, lâu năm thường được sử dụng trong y học dân gian để điều trị ghẻ lở, bệnh ngoài da, hắc lào, mụn nhọt, đau dạ dày và rất có hiệu quả trong việc điều trị các bệnh liên quan đến viêm 14 . Dựa trên những công bố về thành phần hóa học của chi Miliusa cũng như những tác dụng dược lý trong dân gian, thì việc nghiên cứu hoạt tính sinh học của vỏ thân cây Cò Sen (VTCS) sẽ cung cấp những cơ sở khoa học đáng tin cậy cho hoạt tính của loài cây này. Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ gan của cao chiết VTCS trong tổn thương gan do CCl 4 ở chuột thông qua đánh giá một số chỉ tiêu sinh hóa và mô học.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Hóa chất: silymarin (Sigma), trolox (Sigma-Aldrich), ethanol (Trung Quốc), acetic acid (Merck), glutathione (Đài Loan), 5,5’-dithio-bis-nitrobenzoic (Merck), trichloroacetic acid (Merck), hematoxylin (Merck), Eosin Y (BDH, Anh), CCl 4 (Merck), DPPH (Merch), DMSO (Merck) và một số hóa chất khác.

Vật liệu: VTCS được thu tại núi Cấm, tỉnh An Giang vào tháng 06 năm 2018. Mẫu cây được định danh dựa vào các đặc điểm hình thái thực vật trong bộ sách Cây Cỏ Việt Nam dưới sự hỗ trợ của thạc sĩ Phùng Thị Hằng (Bộ môn Sư phạm Sinh học, Khoa Sư phạm, Đại học Cần Thơ). Mẫu được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Thực vật 2, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.

Đối tượng thí nghiệm là chuột nhắt trắng ( Mus musculus var Albino) giống đực khỏe mạnh, trọng lượng từ 30-35 gram do Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp, được nuôi ở phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ ở nhiệt độ phòng và chu kỳ sáng tối 12/12 giờ.

Điều chế cao chiết

VTCS (14200 g) sau khi thu về được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ từ 40–45 o C. Mẫu sau khi khô được xay nhuyễn thành mẫu bột. Bột nguyên liệu (4000 g) được cho vào trong túi vải và ngâm dầm trong ethanol (10 L). Mẫu được ngâm 3 lần, mỗi lần ngâm khoảng 24 giờ, dịch chiết từ các lần ngâm được gom lại, cô đuổi dung môi 15 thu được 155,2 g cao ethanol VTCS, cao chiết có ẩm độ 4,68±0,05% được xác định dựa vào cân phân tích độ ẩm hồng ngoại FD-610 (Kett, Janpen).

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

Phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết được xác định nhờ phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH của Sharma & Bhat 16 có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µL DPPH (1000 µg/mL) và 960 µL cao chiết ở những nồng độ khác nhau: 1, 2, 4, 6 8 và 10 µg/mL. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong tối 30 o C trong thời gian 30 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ của DPPH bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 517 nm.

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

Phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết được xác định nhờ phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH của Sharma & Bhat 16 có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µL DPPH (1000 µg/mL) và 960 µL cao chiết ở những nồng độ khác nhau: 1, 2, 4, 6 8 và 10 µg/mL. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong tối 30 o C trong thời gian 30 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ của DPPH bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 517 nm.

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

Phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết được xác định nhờ phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH của Sharma & Bhat 16 có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µL DPPH (1000 µg/mL) và 960 µL cao chiết ở những nồng độ khác nhau: 1, 2, 4, 6 8 và 10 µg/mL. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong tối 30 o C trong thời gian 30 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ của DPPH bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 517 nm.

Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan

Thí nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết được thực hiện theo Kang & Koppula 19 và Phan Kim Định et al. 20 có hiệu chỉnh. Chuột được gây tổn thương gan bằng CCl 4 liều 2,5 mL/kg trọng lượng chuột (CCl 4 pha trong dầu olive theo tỉ lệ 1:4). Chuột khỏe mạnh được chia ngẫu nhiên thành 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 5 con chuột. Các nghiệm thức chuột thí nghiệm được bố trí như sau: chuột bình thường uống nước cất; chuột uống dầu Olive và DMSO 1%; đối chứng bệnh lý (chuột chỉ uống CCl 4 ); đối chứng dương (chuột tổn thương gan điều trị bằng silymarin liều 16 mg/kg trọng lượng); chuột tổn thương gan điều trị bằng cao chiết VTCS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg hoặc 400 mg/kg trọng lượng. Thời gian thí nghiệm kéo dài 4 tuần, kết thúc thí nghiệm chuột được cân trọng lượng, gây mê giải phẫu lấy máu ở tim để xét nghiệm sinh hóa (alanine transaminase, aspartate transaminase) gan được tách lấy rửa qua dung dịch sinh lý và chia làm hai phần, một phần để phân tích sinh hóa (malondialdehyd, glutathione) và phần còn lại thực hiện tiêu bản mô học.

Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan

Thí nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết được thực hiện theo Kang & Koppula 19 và Phan Kim Định et al. 20 có hiệu chỉnh. Chuột được gây tổn thương gan bằng CCl 4 liều 2,5 mL/kg trọng lượng chuột (CCl 4 pha trong dầu olive theo tỉ lệ 1:4). Chuột khỏe mạnh được chia ngẫu nhiên thành 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 5 con chuột. Các nghiệm thức chuột thí nghiệm được bố trí như sau: chuột bình thường uống nước cất; chuột uống dầu Olive và DMSO 1%; đối chứng bệnh lý (chuột chỉ uống CCl 4 ); đối chứng dương (chuột tổn thương gan điều trị bằng silymarin liều 16 mg/kg trọng lượng); chuột tổn thương gan điều trị bằng cao chiết VTCS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg hoặc 400 mg/kg trọng lượng. Thời gian thí nghiệm kéo dài 4 tuần, kết thúc thí nghiệm chuột được cân trọng lượng, gây mê giải phẫu lấy máu ở tim để xét nghiệm sinh hóa (alanine transaminase, aspartate transaminase) gan được tách lấy rửa qua dung dịch sinh lý và chia làm hai phần, một phần để phân tích sinh hóa (malondialdehyd, glutathione) và phần còn lại thực hiện tiêu bản mô học.

Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan

Thí nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết được thực hiện theo Kang & Koppula 19 và Phan Kim Định et al. 20 có hiệu chỉnh. Chuột được gây tổn thương gan bằng CCl 4 liều 2,5 mL/kg trọng lượng chuột (CCl 4 pha trong dầu olive theo tỉ lệ 1:4). Chuột khỏe mạnh được chia ngẫu nhiên thành 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 5 con chuột. Các nghiệm thức chuột thí nghiệm được bố trí như sau: chuột bình thường uống nước cất; chuột uống dầu Olive và DMSO 1%; đối chứng bệnh lý (chuột chỉ uống CCl 4 ); đối chứng dương (chuột tổn thương gan điều trị bằng silymarin liều 16 mg/kg trọng lượng); chuột tổn thương gan điều trị bằng cao chiết VTCS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg hoặc 400 mg/kg trọng lượng. Thời gian thí nghiệm kéo dài 4 tuần, kết thúc thí nghiệm chuột được cân trọng lượng, gây mê giải phẫu lấy máu ở tim để xét nghiệm sinh hóa (alanine transaminase, aspartate transaminase) gan được tách lấy rửa qua dung dịch sinh lý và chia làm hai phần, một phần để phân tích sinh hóa (malondialdehyd, glutathione) và phần còn lại thực hiện tiêu bản mô học.

Thống kê phân tích số liệu

Số liệu được trình bày bằng giá trị trung bình±sai số chuẩn của các giá trị trung bình (SEM). Kết quả được xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA bằng phần mềm Minitab 16.0 và Excel. Hoạt tính kháng oxy hóa được so sánh với chất chuẩn trolox dựa trên giá trị EC 50 , nồng độ tại đó chất chuẩn hay cao chiết khử hoặc trung hòa được 50% gốc tự do (EC 50 -Effective Concentration of 50%).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết VTCS

Hiệu quả kháng oxy hóa của cao chiết VTCS theo 3 phương pháp là TAC, FRAP và DPPH đã được thực hiện và trình bày trong Figure 1 . Hoạt tính kháng oxy hóa tổng được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0392x + 0,3447 (R²=0,9963). Theo đó, cao chiết VTCS (EC 50 =3,96±0,04 µg/mL) có khả năng khử Mo (VI) thành Mo (V) mạnh hơn trolox (EC 50 =35,02±0,40 µg/mL) là 8,84 lần. Dựa vào phương trình tuyến tính y = 0,0875x + 0,2701 (R² = 0,9995) và kết quả trình bày ở Figure 2 cho thấy, tiềm năng khử (FRAP) của cao chiết VTCS kém hơn trolox chỉ 2,57 lần. Nguyên nhân là do sự hiện diện của các chất kháng oxy hoá trong cao chiết làm giảm dạng oxy hoá sắt (Fe 3+ ) thành dạng khử (Fe 2+ ) bằng cách cho một điện tử 24 . Không những thế, cao chiết VTCS còn có khả năng trung hòa các gốc tự do DPPH với phương trình hồi quy tuyến tính y = 5,0791x + 2,6406 (R²=0,999) và giá trị EC 50 là 9,33±0,07 µg/mL, kém hơn chất chuẩn trolox 14,35 lần.

Figure 1 . Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết VTCS

Ảnh hưởng của cao chiết VTCS đến trọng lượng chuột

Sự gia tăng trọng lượng cơ thể chuột và tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể chuột sau 4 tuần thí nghiệm ở các nghiệm thức được thể hiện cụ thể trong Figure 2 . Khi so sánh giữa các nghiệm thức đối chứng với nhau, chuột ở nghiệm thức uống nước cất và Olive+DMSO 1%, đạt 6,7±0,67 gram và 5,7±0,49 gram, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Từ đó chứng tỏ, olive và DMSO 1% không ảnh hưởng đến chuột. Trong khi đó, chuột ở nghiệm thức uống CCl 4 có khối lượng cơ thể bị giảm so với khối lượng ban đầu. Ở nghiệm thức này, sau khi cho uống CCl 4 , chuột bị lừ đừ, ít hoạt động, chán ăn, một số con lông ở gần phần đuôi bị ướt, đôi khi bị tiêu chảy trong quá trình thí nghiệm nên trọng lượng chuột không tăng như các nghiệm thức khác. Theo nghiên cứu của Phan Kim Định et al. 25 , sự gia tăng trọng lượng nhóm chuột uống CCl 4 ít hơn nhóm chuột bình thường.

Figure 2 . Ảnh hưởng của cao chiết vỏ thân cây Cò Sen đến trọng lượng chuột. Ghi chú: BT-chuột bình thường uống nước cất; DMSO-chuột bình thường uống dầu olive và DMSO 1%; CCl 4 -chuột bình thường uống CCl 4 và DMSO 1%; Si16-chuột bình thường uống CCl 4 và silymarin 16 mg/kg; CS100-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 100 mg/kg; CS200-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 200 mg/kg; CS400-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 400 mg/kg.

Trong khi đó, chuột bị tổn thương gan bởi CCl 4 được điều trị bằng cao chiết VTCS có sự gia tăng trọng lượng cơ thể tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết. Chuột được cho uống cao VTCS có trọng lượng gia tăng khác biệt có ý nghĩa so với nhóm chuột uống nước cất, silymarin lần lượt là 1,1 và 1,97 lần. Trái ngược với sự gia tăng trọng lượng cơ thể, chuột uống CCl 4 có tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể là 9,28±0,23% cao nhất trong các nghiệm thức được khảo sát. Điều này là do CCl 4 là một loại chất độc gây trương phồng tế bào, cho nên làm cho các tế bào gan phình to lên 26 , do đó trọng lượng của gan tăng lên nhanh hơn trọng lượng cơ thể. Cao chiết VTCS được sử dụng ở các liều 100, 200 và 400 mg/kg làm cho tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể giảm dần theo nồng độ cao chiết. Xét về mặt thống kê, tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể ở nhóm chuột bình thường tương đương với nhóm chuột sử dụng cao chiết và silymarin. Từ đó, cho thấy hiệu quả bảo vệ gan của cao chiết VTCS trong việc duy trì trọng lượng gan tương đương với nhóm bình thường.

Ảnh hưởng của cao chiết VTCS đến hình thái gan chuột

Khả năng tổn thương gan của CCl 4 và bảo vệ gan của cao chiết VTCS được đánh giá cảm quan qua việc quan sát hình thái gan chuột trong Figure 3 . Kết quả cho thấy, chuột uống nước cất ( Figure 3 A) và chuột uống DMSO 1% ( Figure 3 B) gan có bề mặt trơn láng, mềm, mịn và có màu đỏ sậm. Trong khi đó, nhóm chuột uống CCl 4 ( Figure 3 C) gan có kích thước lớn do tế bào gan phình to, bề mặt gan gồ ghề, xơ cứng. Các vùng trên gan có màu sắc không đồng nhất, phần lớn bị tái nhạt và đôi khi trên bề mặt xuất hiện các đốm đen bất thường. Ngoài ra, trên bề mặt gan ở một số vị trí còn xuất hiện dấu hiệu hoại tử. Từ dó cho thấy, chuột được cho uống CCl 4 đã gây tổn thương gan dẫn đến xơ gan và hoại tử. Riêng nhóm chuột cho uống CCl 4 và điều trị bằng silymarin liều 16 mg/kg trọng lượng chuột ( Figure 3 D), gan chuột có nhiều cải thiện về mặt hình thái. Bề mặt gan chuột điều trị bằng silymarin đã láng mịn hơn, nhưng vẫn chưa phục hồi hoàn toàn như gan chuột bình thường. Tuy nhiên, gan chuột điều trị bằng silymarin đã có sự cải thiện rõ rệt so với nhóm gây bệnh CCl 4 . Cao chiết VTCS được sử dụng cho thấy hoạt động bảo vệ gan hiệu quả. Cụ thể như sau, màu sắc gan ở nồng độ 100 mg/kg ( Figure 3 E) tuy nhạt màu hơn nhóm bình thường, nhưng bề mặt gan đã giảm sự ghồ ghề. Ở nồng độ 200 ( Figure 3 F) và 400 mg/kg ( Figure 3 G), màu sắc gan kể cả độ láng và các đặc điểm hình thái rất giống với nhóm chuột bình thường.

Figure 3 . Hình thái bên ngoài của gan chuột ở các nghiệm thức. Ghi chú: A-chuột bình thường uống nước cất; B-chuột bình thường uống dầu Olive và DMSO 1%; C-chuột bình thường uống CCl 4 và DMSO 1%; D-chuột bình thường uống CCl 4 và silymarin 16 mg/kg; E-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 100 mg/kg; F-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 200 mg/kg; G-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 400 mg/kg.

Ảnh hưởng của cao chiết VTCS đến hàm lượng enzyme ALT và AST

Tổn thương gan nói chung sẽ đi kèm với sự gia tăng hàm lượng các enzyme ALT và AST 27 . Như thể hiện trong Table 1 , hàm lượng enzyme ALT và AST của những con chuột được cho uống CCl 4 có sự gia tăng đáng kể so với nhóm đối chứng bình thường lần lượt là 10,62 và 35,16 lần (p<0,05). Thông thường, ALT và AST được sử dụng để đánh giá chức năng gan, ALT có độ chính xác cao trong việc theo dõi tình trạng tế bào gan và AST là một chỉ số nhạy cảm của các vấn đề về ty thể, đặc biệt là ở các khu vực trung tâm của gan 28 . Ngoài ra, AST và ALT thường được sử dụng để đánh giá chức năng gan trong tổn thương gan thực nghiệm và lâm sàng 29 . Chuột tổn thương gan bằng CCl 4 và được điều trị bằng cao chiết VTCS ở các liều 100, 200, 400 mg/kg và silymarin liều 16 mg/kg làm giảm đáng kể hàm lượng ALT, AST so với nhóm chuột uống CCl 4 (p<0,05).

Bên cạnh đó, hàm lượng enzyme ALT và AST ở các nhóm chuột sử dụng cao chiết VTCS và silymarin khác biệt không có ý nghĩa so với nhóm chuột bình thường (p>0,05). Từ đó, cho thấy, VTCS có thể bảo vệ gan ở chuột do CCl 4 gây ra điều hòa hàm lượng enzyme ALT, AST tương đương chuột bình thường. Hiệu suất bảo vệ gan được đánh giá thông qua phần trăm giảm hàm lượng enzyme ALT và AST được trình bày trong Table 1 . Khi sử dụng liều 100 mg/kg trọng lượng chuột, cao chiết VTCS làm giảm hàm lượng ALT và AST đáng kể so với nhóm đối chứng bệnh, hiệu suất giảm ALT là 85,43±3,60% và AST là 98,51±3,22%. Nhóm chuột uống cao chiết VTCS liều 200 mg/kg thì hàm lượng enzyme ALT và AST trong máu giảm nhiều hơn ở liều 100 mg/kg trọng lượng chuột, hiệu suất giảm ALT và AST lần lượt là 92,11±3,00% và 102,69±0,94%, tương đương với nhóm chuột uống slilymarin. Ở nhóm chuột uống cao chiết VTCS liều 400 mg/kg có tác dụng làm giảm hàm lượng enzyme ALT và AST hiệu quả nhất, hiệu suất giảm ALT là 98,81±0,74 và AST là 104,38±1,21, tương đương chuột bình thường và mạnh hơn silymarin.

Table 1 Hàm lượng enzyme gan (U/L) và hiệu suất bảo vệ gan chuột (%) sau 4 tuần thí nghiệm
Nghiệm thức Hàm lượng enzyme (U/L) Hiệu suất bảo vệ gan (%)
AST ALT AST ALT
BT 146,20b±41,80 27b±11,50 100bc±0,00 100a±0,00
Olive+DMSO 153,80b±32,60 31,80b±10,71 99,46c±2,32 99,48a±1,16
CCl4+DMSO 1552,40a±366,90 949,20a±335,80 0,00e±0,00 0,00d±0,00
CCl4+Si 16 219,20b±65,50 91,20b±29,30 94,81d±4,66 93,04b±3,18
CCl4+VTCS 100 167,20b±45,22 161,40b±33,18 98,51c±3,22 85,43c±3,60
CCl4+VTCS 200 108,40b±13,26 99,80b±27,63 102,69ab±0,94 92,11b±3,00
CCl4+VTCS 400 84,60b±17,01 38b±6,78 104,38a±1,21 98,81a±0,74

Ảnh hưởng của cao chiết VTCS đến hàm lượng MDA và GSH

Stress oxy hóa đóng vai trò chính trong tổn thương gan do sản xuất các dẫn xuất gốc tự do của CCl 4 dẫn đến sự phá hủy màng tế bào và giải phóng các enzyme đánh dấu độc tính gan 30 . Stress oxy hóa gây ra bởi CCl 4 có thể được theo dõi ở động vật thí nghiệm bằng cách phát hiện các thông số như MDA 31 . Sự peroxy hóa lipid đã được đưa ra giả thuyết là nguyên nhân chính gây tổn thương gan do CCl 4 và do đó có thể được sử dụng như một dấu hiệu của tổn thương oxy hóa. Sự gia tăng MDA như là một đặc điểm của tổn thương gan cũng được coi là một dấu hiệu của peroxid hóa lipid 32 . Trong nghiên cứu hiện tại, hàm lượng MDA ở gan chuột bị tổn thương bởi CCl 4 tăng cao lên đến 45,76±0,47 nM MDA/g mô cao gấp 5,24 lần so với chuột bình thường (8,74±1,05 nM MDA/g mô). Hàm lượng MDA đã giảm đáng kể khi được điều trị bằng silymarin và cao chiết VTCS (100, 200 và 400 mg/kg). Cụ thể, cao chiết VTCS sử dụng ở liều 100 mg/kg (17,61±2,35 nM MDA/g mô) cho hàm lượng MDA tương đương với silymarin (16,55±1,80 nM MDA/g mô). Trong khi đó, cao chiết sử dụng ở liều 200 mg/kg có hàm lượng MDA là 8,59±1,56 nM MDA/g mô tương đương với nhóm chuột bình thường. Hàm lượng MDA khi sử dụng cao chiết VTCS liều 400 mg/kg giảm chỉ còn 3,12±1,19 nM MDA/g mô thấp chuột bình thường 2,08 lần và chuột uống CCl 4 14,67 lần. Quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào vẫn xảy ra trong cơ thể bình thường, nên khi bổ sung một chất kháng oxy hóa vào cơ thể bình thường cũng góp phần làm giảm sản phẩm của quá trình oxy hóa. VTCS có chứa acetogenin-A và acetogenin-B 33 . Những hợp chất acetogenin đã được chứng minh có hoạt động kháng oxy hóa mạnh với khả năng trung hòa gốc tự do DPPH tương đương với ascorbic acid 34 . Chính nhờ vào việc sử dụng cao chiết VTCS có chứa những hợp chất sở hữu khả năng kháng oxy hóa đã làm giảm quá trình peroxy hóa lipid ở chuột bình thường và chuột bị tổn thương gan. Nghiên cứu của Phan Kim Định et al. 35 cũng cho thấy chuột sử dụng cao chiết thực vật có hàm lượng MDA ở gan thấp hơn so với nhóm chuột bình thường.

Figure 4 . Hàm lượng malondialdehyde và glutathion trong gan chuột. Ghi chú: BT-chuột bình thường uống nước cất; DMSO-chuột bình thường uống dầu olive và DMSO 1%; CCl 4 -chuột bình thường uống CCl 4 và DMSO 1%; Si16-chuột bình thường uống CCl 4 và silymarin 16 mg/kg; CS100-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 100 mg/kg; CS200-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 200 mg/kg; CS400-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 400 mg/kg.

Glutathione dạng khử (reduced glutathione, GSH) là nhóm thiol nội bào phổ biến nhất, với nồng độ nội bào có thể lên đến 10000 nmol. Ở dạng khử, GSH là một chất kháng oxy hoá đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ tế bào khỏi tác hại của gốc tự do, làm giảm chất oxy hóa nội sinh và stress oxy hoá ngoại sinh 36 , 37 . Gây tổn thương gan bằng CCl 4 làm giảm GSH trong gan và các chất bảo vệ gan hiệu quả sẽ làm phục hồi hàm lượng GSH trong gan 38 . Khả năng bảo vệ gan của cao chiết VTCS dựa vào hàm lượng GSH trong mô gan được trình bày trong Figure 4 , hàm lượng GSH của nhóm chuột uống CCl 4 (31,74±14,82 nM GSH/g mô) thấp hơn nhóm chuột bình thường (177,16±16,65 nM GSH/g mô) là 5,58 lần. Ở nhóm chuột gây bệnh được điều trị bằng silymarin hàm lượng GSH đã tăng lên đến 769,71±19,13 nM GSH/g mô). Các nhóm chuột gây bệnh được điều trị bằng cao chiết VTCS có hàm lượng GSH tăng từ 101,22±5,06 nM GSH/g mô ở liều 100 mg/kg lên 896,21±22,69 nM GSH/g mô ở nồng độ 400 mg/kg. Như vậy, ở liều 100 mg/kg cao chiết VTCS đã có thể điều hòa lượng GSH tương đương với hàm lượng GSH ở nhóm chuột bình thường. Điều trị bằng cao chiết VTCS ở nồng độ 400 mg/kg làm cho GSH tăng cao hơn chuột được cho uống silymarin liều 16 mg/kg là 1,16 lần.

Ảnh hưởng của cao chiết VTCS đến cấu trúc mô học gan chuột

Nhiễm độc CCl 4 được đặc trưng bởi sự gia tăng tế bào kupffer và mono. Việc kích hoạt các tế bào kupffer bằng các quá trình viêm trung gian CCl 4 thông qua con đường truyền tín hiệu kappa B (NF-kB) với việc sản xuất các cytokine gây viêm có liên quan đến việc điều hòa sự tăng sinh tế bào và apoptosis 39 . Cấu trúc vi thể mô gan có những thay đổi lớn do CCl 4 gây ra dẫn đến tăng đại thực bào, tế bào nhân đông, tế bào nhân tan và tế bào mất nhân. Kích thước tế bào to bất thường, không xếp thành dãy tế bào ( Figure 5 C). Kết quả này có sự tương đồng với nghiên cứu của Phan Kim Định et al. 24 . Khi so sánh với nhóm chuột uống nước cất, cấu trúc gan với các tế bào tròn đều xếp khít nhau tạo thành các dãy hướng tĩnh mạch, nhìn rõ được xoang gan ( Figure 5 A). Tổn thương gan đã giảm khi sử dụng cao chiết VTCS (100, 200, 400 mg/kg) và silymarin 16 mg/kg, số lượng các đại thực bào cũng như những tế bào bất thường giảm đáng kể so với nhóm chuột bị tổn thương bởi CCl 4 . Kết quả mô học chứng minh rằng việc sử dụng VTCS ngăn ngừa đáng kể tổn thương gan do CCl 4 gây ra. Cơ chế hoạt động của các cao chiết thực vật được quy cho các đặc tính kháng oxy hóa làm tăng hàm lượng GSH trong máu, tăng protein tổng số, ức chế peroxid hóa lipid và tăng hoạt tính của các enzyme kháng oxy hóa khác 40 . Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cũng chứng minh rằng các cao chiết thực vật sở hữu khả năng kháng oxy hóa làm tăng hàm lượng các enzyme kháng oxy hóa trong các mô 41 . Chính vì vậy, mô gan của chuột đã được phục hồi đáng kể khi sử dụng cao chiết VTCS.

Figure 5 . Sự thay đổi cấu trúc vi thể mô gan chuột ở các nghiệm thức được khảo sát. Ghi chú: A-chuột bình thường uống nướccất; B-chuột bình thường uống dầu olive và DMSO 1%; C-chuột bình thường uống CCl 4 và DMSO 1%; D-chuột bình thường uống CCl 4 và silymarin 16 mg/kg; E-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 100 mg/kg; F-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 200 mg/kg; G-chuột bình thường uống CCl 4 và cao chiết VTCS liều 400mg/kg.

1: Tĩnh mạch, 2: Tế bào gan bình thường, 3: Xoang gan, 4: Dãy tế bào gan, 5: Tế bào mono, 6: Tế bào Kupffer, 7: Ống mật, 8: Tế bào nhân tan, 9: Tế bào nhân đông, 10: Tế bào mất nhân, 11: Giọt mỡ, 12: Tế bào phồng to.

KẾT LUẬN

Vỏ thân cây Cò Sen sở hữu hoạt tính bảo vệ gan thông qua việc tăng cường hoạt động của enzyme kháng oxy hóa, ức chế quá trình peroxid hóa lipid. Hoạt động bảo vệ gan của vỏ thân cây Cò Sen có thể liên quan mật thiết với hoạt tính kháng oxy hóa cũng như những hợp chất thiên nhiên giàu hoạt tính sinh học có ở loài thực vật này.

LỜI CẢM ƠN

Các tác giả xin trân trọng cảm ơn Sở Khoa học và Công nghệ Tỉnh An Giang đã hỗ trợ kinh phí thực hiện nghiên cứu này.

DANH MỤC VIẾT TẮT

ALT: Alanine transaminase

AST: Aspartate transaminase

CCl4: Carbon tetrachloride

DMSO: Dimethyl sulfoxide

DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

FRAP: Ferric reducing-antioxidant power

GSH: Glutathione

MDA: Malondialdehyd

MV: Miliusa velutina

TAC: Total antioxidant capacity

VTCS: Vỏ thân cây Cò Sen

CAM KẾT XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả tuyên bố không có xung đột lợi ích liên quan đến việc xuất bản của bài viết này.

ĐÓNG GÓP CỦA TÁC GIẢ

Tác giả Đái Thị Xuân Trang đã tiến hành tất cả các thí nghiệm, thu thập dữ liệu, phân tích kết quả và phác thảo bản thảo; tác giả Trần Chí Linh và Bùi Lê Trung Hiếu đã thực hiện thí nghiệm phân tích ALT, AST và mô bệnh học gan chuột; tác giả Nguyễn Trọng Tuân khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro ; tác giả Lưu Thái danh phân tích MDA và GSH; Tất cả các tác giả đã xem xét và phê duyệt bản thảo.

References

  1. Asrani SK, Devarbhavi H, Eaton J, Kamath PS. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 2019;70(1):151-171. PubMed Google Scholar
  2. Hung MY, Fu TY, Shih PH, Lee CP, Yen GC. Du-Zhong (Eucommia ulmoides Oliv.) leaves inhibits CCl4-induced hepatic damage in rats. Food and Chemical Toxicology. 2006;44:1424-1431. PubMed Google Scholar
  3. Shen X, Tang Y, Yang R, Yu L, Fang T, Duan JA. The protective effect of Zizyphus jujube fruit on carbon tetrachloride-induced hepatic injury in mice by anti-oxidative activities. Journal of Ethnopharmacology. 2009;122:555-560. PubMed Google Scholar
  4. Andrade KQ, Moura FA, Santos JM, Araujo OR, Farias Santos JC, Goulart MO. Oxidative stress and inflammation in hepatic diseases: Therapeutic possibilities of N‐Acetylcysteine. International Journal of Molecular Sciences. 2015;16(12):30269-30308. PubMed Google Scholar
  5. Srivastava S, Choudhary GP. Pharmacognostic and pharmacological study of Fumaria vaillantii Loisel. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry. 2014;3:194-197. Google Scholar
  6. Jaishree V, Badami S. Antioxidant and hepatoprotective effect of swertiamarin from Enicostemma axillare against D-galactosamine induced acute liver damage in rats. Journal of Ethnopharmacology. 2010;130:103-106. PubMed Google Scholar
  7. Chaowasku T, Paul JAK. Miliusa cambodgensis sp. nov. (Annonaceae) from Cambodia and M. astiana, M. ninhbinhensis spp. nov. from Vietnam. Nordic Journal of Botany. 2014;:1-10. Google Scholar
  8. Promchai T, Saesong T, Ingkaninan K, Laphookhieo S, Pyne SG, Limtharakul T. Acetylcholinesterase inhibitory activity of chemical constituents isolated from Miliusa thorelii. Phytochemistry Letters. 2018;23:33-37. Google Scholar
  9. Wongsa N, Kanokmedhakul S, Kanokmedhakul K. Corrigendum to "Cananginones A-I, linear acetogenins from the stem bark of Cananga latifolia". Phytochemistry. 2015;109:154. Google Scholar
  10. Zhang HJ, Ma C, Hung NV, Cuong NM, Tan GT, Santarsiero BD, Mesecar AD, Soejarto DD, Pezzuto JM, Fong HHS. Miliusanes, a class of cytotoxic agents from Miliusa sinensis. Journal of Medicinal Chemistry. 2006;49:693-708. PubMed Google Scholar
  11. Brophy JJ, Goldsack RJ, Forster PI. The leaf oils of the Australian species of Miliusa (Annonaceae). Journal of Essential Oil Research. 2004;16:253-255. Google Scholar
  12. Wongsa N, Kanokmedhakul K, Boonmak J, Youngme S, Kanokmedhakul S. Bicyclic lactones and racemic mixtures of dimeric styrylpyrones from the leaves of Miliusa velutina. Royal Society of Chemistry Advances. 2017;7:25285-25297. Google Scholar
  13. Naphong C, Pompimon W, Sombutsiri P. Anticancer activity of isolated chemical constituents from Miliusa smithiae. American Journal of Applied Sciences. 2013;10:787-792. Google Scholar
  14. Chi VV. Cây thuốc An Giang. Ủy Ban Khoa học Kỹ thuật An Giang. 1991;:154. Google Scholar
  15. Phụng NKP. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Tp. HCM. 2007;:80-147. Google Scholar
  16. Sharma OP, Bhat TK. DPPH antioxidant assay revisited. Food Chemistry. 2009;113:1202-1205. Google Scholar
  17. Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of 'antioxidant power': the FRAP assay. Analytical Biochemistry. 1996;239(1):70-76. PubMed Google Scholar
  18. Prieto P, Pineda M, Aguilar M. Spectrophotometric quantification of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: Specific application to the determination of vitamin E. Analytical Biochemistry. 1999;269:337-341. PubMed Google Scholar
  19. Kang H, Koppula S. Hepatoprotective effect of Houttuynia cordata Thunb extract against carbon tetrachlorideinduced hepatic damage in mice. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2014;76(4):267-273. Google Scholar
  20. Dinh PK, Tuan NT, Trang DTX. Antioxidant, anti-inflammatory and hepatoprotective activities on carbon tetrachloride-induced hepatic damage in mice of Ixora duffii leaf extract. Tạp chí Sinh học. 2019;41(1):117-128. Google Scholar
  21. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxidation in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical Biochemistry. 1979;95:351-358. Google Scholar
  22. Moron M, Depierre JW, Mannervik B. Levels of glutathione, glutathione reductase and glutathione s-transferase activity in rat lung and liver. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1979;582:67-78. Google Scholar
  23. Saalu LC, Ogunlade B, Ajayi GO, Oyewopo AO, Akunna GG, Ogunmodede OS. The hepatoprotective potentials of Moringa oleifera leaf extract on alcohol-induced hepatotoxicity in wistar rat. American Journal of Biotechnology and Molecular Sciences. 2012;2(1):6-14. Google Scholar
  24. Öztaşkin N, Çetinkaya Y, Taslimi P, Göksu S, and Gülçin I. Antioxidant and acetylcholinesterase inhibition properties of novel bromophenol derivatives. Bioorganic Chemistry. 2015;60:49-57. PubMed Google Scholar
  25. Định PK, Lan NTT., Tuân NT, Trang ĐTX. Khảo sát khả năng bảo vệ gan của cao methanol lá Mơ leo (Paederia scandens L.) trên chuột tổn thương gan bằng carbon tetrachloride. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 2018;54(7A):94-100. Google Scholar
  26. Simeonova R, Vitcheva V, Kondeva-Burdina M, Krasteva I, Manov V, Mitcheva M. Hepatoprotective and antioxidant effects of saponarin, isolated from Gypsophila trichotoma Wend. on paracetamol-induced liver damage in rats. BioMed Research International. 2013;:757126. PubMed Google Scholar
  27. Islam MS, Yu H, Miao L, Liu Z, He Y, Sun H. Hepatoprotective effect of the ethanol extract of Illicium henryi against acute liver injury in mice induced by Lipopolysaccharide. Antioxidants (Basel, Switzerland). 2019;8(10):446. PubMed Google Scholar
  28. Wang Y, Tang C, Zhang H. Hepatoprotective effects of kaempferol 3-O-rutinoside and kaempferol 3-O-glucoside from Carthamus tinctorius L. on CCl4-induced oxidative liver injury in mice. Journal of Food and Drug Analysis. 2015;23(2):310-317. PubMed Google Scholar
  29. Chen G, Deng H, Song X, Lu M, Zhao L, Xia S, You G, Zhao J, Zhang Y, Dong A, et al. Reactive oxygen species-responsive polymeric nanoparticles for alleviating sepsis-induced acute liver injury in mice. Biomaterials. 2017;144:30-41. PubMed Google Scholar
  30. Chiu YJ, Chou SC, Chiu CS, Kao CP, Wu KC, Chen CJ, et al. Hepatoprotective effect of the ethanol extract of Polygonum orientale on carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice. Journal of Food and Drug Analysis. 2018;26(1):369-379. PubMed Google Scholar
  31. Szymonik-Lesiuk S, Czechowska G, Stryjecka-Zimmer M, Slomka M, Madro A, Celinski K, et al. Catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase activities in various rat tissues after carbon tetrachloride intoxication. Journal of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery. 2003;10(4):309-315. PubMed Google Scholar
  32. Mateos R, Lecumberri E, Ramos S, Goya L, Bravo L. Determination of malondialdehyde (MDA) by high-performance liquid chromatography in serum and liver as a biomarker for oxidative stress: application to a rat model for hypercholesterolemia and evaluation of the effect of diets rich in phenolic antioxidants from fruits. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2005;827(1):76-82. PubMed Google Scholar
  33. Syeda J, Choudhury HM, Mohammad A, Rashid U. Antibacterial activity and cytotoxicity of Miliusa velutina. Fitoterapia. 2000;71:559-561. Google Scholar
  34. Lima LARS, Pimenta LPS, Boaventura MAD. Acetogenins from Annona cornifolia and their antioxidant capacity. Food Chemistry. 2010;122(4):1129-1138. Google Scholar
  35. Định PK, Tuân NT, Trang ĐTX. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của cao chiết lá gáo trắng (Neolamarckia cadamba (Roxb.) Bosser). . Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 2019;55(5A):24-31. Google Scholar
  36. Yuan L, Kaplowitz N. Review Glutathione in liver diseases and hepatotoxicity. Molecular Aspects of Medicine. 2009;30(1-2):29-41. PubMed Google Scholar
  37. Enns GM, Cowan TM. Review Glutathione as a redox biomarker in mitochondrial disease-implications for therapy. Journal of Clinical Medicine. 2017;6(5):50. PubMed Google Scholar
  38. Lu Y, Chen J, Ren D, Yang X, Zhao Y. Hepatoprotective effects of phloretin against CCl4-induced liver injury in mice. Food and Agricultural Immunology. 2017;28(2):211-222. Google Scholar
  39. Bak J, Je NK, Chung HY, Yokozawa T, Yoon S, Moon JO. Oligonol ameliorates CCl4-induced liver injury in rats via the NF-Kappa B and MAPK signaling pathways. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016;1:1-12. PubMed Google Scholar
  40. Amit R, Dayananda B, Ram KS, Jaya D. Medicinal Plants Used in Liver Protection - A Review. . UK Journal of Pharmaceutical and Biosciences. 2014;2(1):23-33. Google Scholar
  41. Huang L, Guan T, Qian Y, Huang M, Tang X, et al. Anti-inflammatory effects of maslinic acid, a natural triterpene, in cultured cortical astrocytes via suppression of nuclear factor-kappa B. European Journal of Pharmacology. 2011;672:169-174. PubMed Google Scholar


Author's Affiliation
Article Details

Issue: Vol 4 No 3 (2020): Under Publishing
Page No.: 633-642
Published: Aug 16, 2020
Section: Original Research
DOI: https://doi.org/10.32508/stdjns.v4i3.880

 Copyright Info

Creative Commons License

Copyright: The Authors. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License CC-BY 4.0., which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

 How to Cite
Thị Xuân Trang, Đái, Bui, H., Tran, L., Luu, D., & Nguyen, T. (2020). Antioxidant and hepatoprotective potentials of miliusa velutina stem bark extract. Science and Technology Development Journal - Natural Sciences, 4(3), 633-642. https://doi.org/https://doi.org/10.32508/stdjns.v4i3.880

 Cited by



Article level Metrics by Paperbuzz/Impactstory
Article level Metrics by Altmetrics

 Article Statistics
HTML = 56 times
Download PDF   = 13 times
View Article   = 0 times
Total   = 13 times