Study on genetic diversity of Rose varieties (Rosa spp.) in Sa Dec, Dong Thap using PCR-RAPD technique

Abstract

Roses (Rosa spp.) are highly valuable ornamental plants known for their diverse flower shapes and colors. Rose plants are widely used in Vietnam for decoration, essential oil production, and the cosmetics industry. In Sa Dec Flower Village (Dong Thap province), the Roses plant plays a crucial role in the agricultural economy development. Therefore, techniques for cultivating and developing new varieties of Roses are increasingly emphasized, focusing on diversification to increase the collection of varieties, diversify types and species, preserve forms, and enhance economic efficiency. In this study, PCR-RAPD technique was used on 18 Sa Dec’s rose varieties, resulting in a total of 66 polymorphic bands, with 87.88% being polymorphic and 12.12% monomorphic. The dendrogram analysis revealed that the 18 rose varieties from Sa Dec could be divided into two main groups with several smaller subgroups. The correlation between genetic variations in the genome and morphological markers of the 18 rose varieties was analyzed and discussed. The results lay the initial background for understanding the genetic relationships among 18 rose varieties from Sa Dec Flower Village, which could serve as a foundation for collecting, preserving, and developing genetic resources, as well as selecting and designing hybrid pairs to create new rose varieties in Sa Dec Flower Village.

MỞ ĐẦU

Hoa Hồng thuộc chi Rosa (họ Rosaceae) là một loại hoa kiểng với hoa đẹp, đa dạng về màu sắc, hình thái hoa và hương thơm, được khai thác chủ yếu dưới dạng cắt cành hoặc cây trồng chậu 1 . Cây thuộc nhóm thân gỗ, bụi thấp hoặc dạng thân leo lâu năm, thân cây có nhiều cành và gai dạng cong. Ngày nay, việc sưu tập, tuyển chọn, lai tạo, cũng như áp dụng các phương pháp cải tiến và phát triển công nghệ trồng trọt đã giúp nguồn giống trồng cây hoa Hồng khá đa dạng chủng loại. Hơn thế nữa, cây hoa Hồng cũng dần dần được xem như một loại cây công nghiệp và ngày càng được quan tâm đầu tư phát triển nhằm đáp ứng nhu cầu công nghệ dược phẩm, mỹ phẩm bên cạnh khai thác phục vụ trang trí 2 .

Nguồn gốc cây hoa Hồng được biết từ những cây hoa hoang dại từ hàng ngàn năm trước với khoảng 200 loài hoang dại trên thế giới, các giống hoa Hồng phổ biến ngày nay là kết quả của sự lai tạo giữa các giống hoa Hồng từ Trung Quốc, Châu Âu và Trung Đông 3 . Hiện nay, nước ta có rất nhiều giống hoa Hồng bản địa hoặc du nhập từ rất lâu và dần dần đã thuần hóa, thích nghi với điều kiện khí hậu Việt Nam. Từ xưa, hoa Hồng chủ yếu được trồng và phát triển tốt ở các vùng có khí hậu với nhiệt độ thấp như Đà Lạt, Hà Nội, Sa Pa, Lai Châu,… Gần đây việc trồng hoa Hồng ngày càng phổ biến và mở rộng, đóng một vai trò quan trọng trong kinh tế nông nghiệp địa phương, trong đó làng hoa Sa Đéc (tỉnh Đồng Tháp) là một trong những địa phương có nhiều đầu tư và cũng đã đạt được một số kết quả quan trọng trong công tác phát triển cây hoa Hồng. Việc phân loại cây hoa Hồng còn khá nhiều tranh luận trong nhiều thập kỷ qua và phụ thuộc vào quan điểm của các nhà phân loại học thực vật. Nhiều tác giả Châu Âu đã cố gắng xây dựng khóa phân loại cho cây hoa Hồng dựa trên hình thái học, tuy nhiên có nhiều yếu tố ảnh hưởng như: sự khác biệt hình thái do thích nghi với môi trường, hạn chế khu vực và số lượng mẫu. Do đó, cho đến nay vẫn chưa có khóa phân loại thống nhất cho cây hoa Hồng 4 . Công tác đăng ký và bảo vệ bản quyền giống cây hoa Hồng thường được thực hiện dựa trên đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh lý theo quy tắc của Liên minh Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới 5 . Tuy nhiên, các đặc tính chuẩn hóa của UPOV có thể sẽ thiếu chuẩn xác khi số lượng các giống hoa Hồng ngày càng gia tăng và sự phân biệt kiểu hình giữa các giống ngày càng trở nên khó khăn 6 .

Trong phân tích đa dạng di truyền ở thực vật với các chỉ thị phân tử như ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) , RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)… ngày càng được sử dụng phổ biến, từ những lợi thế rõ ràng của phương pháp so với sử dụng hình thái học truyền thống vì chúng gắn liền với vật chất di truyền, ổn định qua các giai đoạn phát triển của thực vật, ít bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường 7 . Trong đó, RAPD là kỹ thuật nhân bản DNA hệ gen bằng phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên để đánh giá sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở vị trí bắt mồi 8 . PCR-RAPD đã được sử dụng nhằm mục đích xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống trồng trong cùng loài với số lượng băng đa hình cao, kết quả đáng tin và có thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung dễ thực hiện mà không cần biết trước thông tin DNA 9 . Trên thế giới, PCR-RAPD được áp dụng từ rất sớm như chỉ thị phân tử để xác định đa dạng di truyền và phân loại ở cây hoa Hồng 10 , 11 , 12 , các giống hoa Hồng cắt cành 13 , 14 , cũng như nghiên cứu đa dạng di truyền của các phân loài hoa Hồng bản địa ở Iran 15 , quần thể hoa Hồng thơm Pelargonium 16 , giữa các loài hoa Hồng hoang dại ( Rosa L. spp.) 17 . Tuy nhiên, tại Việt Nam các nghiên cứu về giống và phân tích mối quan hệ di truyền của các giống hoa Hồng còn ít, đặc biệt là khu vực miền Nam. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền của một số giống hoa Hồng ( Rosa spp.) ở làng hoa Sa Đéc dựa trên một số biểu hiện hình thái và chỉ thị phân tử PCR-RAPD.

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Sử dụng 18 giống hoa Hồng ( Rosa spp.) được cung cấp từ vườn sưu tập Công ty TNHH DTC Phù Sa, làng hoa Sa Đéc (phường Tân Quy Đông, thành phố Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp) và được trồng trong chậu tại vườn thực nghiệm Sinh lý thực vật, Khoa Sinh học - Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ( Table 1 ).

Table 1 Tên và kí hiệu của 18 giống hoa Hồng ở Sa Đéc

Phân tích hình thái

Các đặc điểm hình thái gồm dạng thân, phiến lá, kiểu dạng hoa, đường kính hoa (chiều ngang lớn nhất khi hoa nở hoàn toàn) của 18 giống hoa Hồng được chụp ảnh và phân tích 18 . Mỗi phân tích được thực hiện lặp lại trên 5 mẫu cây hoa Hồng.

Tách chiết DNA bộ gen

Các mẫu lá hoa Hồng được cô lập và bảo quản ở 4 ^o C, DNA của mẫu lá được tách chiết bộ gen bằng bộ tách chiết DNA thực vật i-genomic (iNtRON Biotechnology, Korea). DNA bộ gen được kiểm tra tính nguyên vẹn thông qua điện di trên gel agarose; hàm lượng, độ tinh sạch DNA được xác định bằng cách đo OD, sau đó các mẫu DNA được pha loãng về cùng một nồng độ 100 ng/µl và bảo quản ở ­20 ^o C để thực hiện phản ứng PCR-RAPD.

Phân tích đa dạng di truyền giữa 18 giống trồng hoa Hồng bằng kỹ thuật PCR-RAPD

Sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên được lựa chọn để thực hiện phản ứng PCR-RAPD nhằm phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu hoa Hồng ( Table 2 ). Phản ứng khuếch đại thực hiện với thể tích phản ứng 25 µL: 2 µL mồi (0,8 ng/µL), 12,5 µL toptaq master mix kit, 1 µL (100 ng/µL) DNA bộ gen, 9,5 µL nước. Thực hiện phản ứng PCR với chu kì nhiệt: 94°C (3 phút), 40 chu kì tiếp theo: 94°C (30 giây), 34°C (30 giây), 72°C (1 phút) và sau cùng 72°C (10 phút); sản phẩm PCR được nhận dạng bằng điện di trên gel agarose sau khi nhuộm ethidium bromide, với hiện diện của thang DNA 100 bp, dưới nguồn sáng tử ngoại.

Table 2 Trình tự mồi ngẫu nhiên được sử dụng cho phân tích PCR-RAPD

Phân tích kết quả gel điện di và xử lý thống kê

Kết quả điện di sản phẩm PCR- RAPD với các mồi ngẫu nhiên được sử dụng để xác định các phân đoạn DNA đa hình và đơn hình dựa trên sự xuất hiện của các băng điện di giữa các mẫu nghiên cứu. Các băng xuất hiện trên bảng điện di được ghi nhận là 1, không xuất hiện là 0 và lập bảng mã hóa nhị phân cho toàn bộ 18 giống hoa Hồng, với 10 primer.

Bảng mã hóa nhị phân được sử dụng để xây dựng ma trận hệ số tương đồng Jaccard bằng phần mềm NTSYS-pc phiên bản 2.1, chức năng SIMQUAL 23 . Sơ đồ cây phả hệ (dendrogram) được xây dựng theo phương pháp UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages) bằng phần mềm R, phiên bản 4.12 với các gói thư viện “vegan” và “phangorn”. Phân tích tọa độ chính (PCoA) được biểu diễn bằng phần mềm GenAlEx phiên bản 6.5 24 .

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Đặc điểm hình thái một số giống hoa Hồng Sa Đéc

Sự đa dạng ở cây hoa Hồng được đánh giá dựa trên hình dáng cây, màu sắc và kích thước hoa 18 . Trong nghiên cứu này, 18 mẫu hoa Hồng khảo sát ghi nhận 2 dạng hình thái hoa gồm 12 mẫu dạng hoa cụm (mang từ 2 đến 5 hoa trên cùng 1 trục mang hoa) và 6 mẫu có dạng hoa đơn (chỉ mang 1 hoa trên 1 trục mang hoa) ( Table 3 , Figure 1 ). Đối với những mẫu hoa Hồng mang cụm hoa, thường đi kèm là kích thước hoa nhỏ, không vượt quá 5 cm; những mẫu hoa Hồng mang hoa đơn có kích thước hoa thường lớn hơn 5 cm. Bên cạnh đó, kiểu dáng thân và đặc điểm của lá cũng được sử dụng trong phân loại các giống hoa Hồng 18 . Trong tự nhiên, hoa Hồng có các dạng thân như: thân bụi, thân gỗ và thân leo. Các mẫu hoa Hồng Sa Đéc thuộc hai dạng gồm thân leo với 3 mẫu (hồng Dại, hồng Pháp Leo và hồng Tường Vy), và 15 mẫu còn lại thuộc nhóm thân bụi. Tất cả 18 mẫu hoa Hồng đều mang dạng lá kép lông chim mọc cách, hình dạng lá thuôn dài, lá kép mang từ ba đến bảy lá chét. Khi phân tích bề mặt phiến lá, thu được kết quả: bề mặt phiến lá nhẵn (ở cả 2 mặt của phiến lá) được tìm thấy ở 17 mẫu hoa Hồng, chỉ riêng mẫu hoa Hồng Dại là mẫu luôn luôn mang 7 lá chét trên 1 lá kép và bề mặt phiến lá có sự hiện diện nhiều lông tơ ở cả hai bề mặt phiến lá ( Table 3 , Figure 2 ).

Table 3 Một số đặc tính hình thái của 18 mẫu hoa Hồng Sa Đéc

Figure 1 . Các dạng hoa trên cùng một cuống ở hoa Hồng: (A) hoa đơn (hồng Lửa), (B) cụm hoa (hồng Chùm Son).

Figure 2 . Bề mặt lá của hoa Hồng: (A) mặt lá nhẵn (hồng Nhung), (B) mặt lá có lông tơ (hồng Dại), mặt trên lá (1) và mặt dưới lá (2).

Kết quả tách chiết DNA bộ gen

DNA của 18 giống hoa Hồng thu được có nồng độ từ 111 ng/µL đến 247 ng/µL và tỉ lệ OD ₂₆₀ /OD ₂₈₀ từ 1,73 đến 1,88. Kết quả tách chiết cho thấy mẫu DNA thu được rất ít bị nhiễm protein và các đại phân tử khác. Sự hiện diện của các dải băng DNA tách biệt trên bản điện di phản ánh mức độ tinh khiết của bộ gen được phân lập và nguồn DNA này có thể sẵn sàng cho các phản ứng PCR ( Figure 3 ). Nồng độ, độ tinh sạch của mẫu DNA thu được tương tự như các nghiên cứu trước trên cây hoa Hồng và phù hợp để thực hiện các phản ứng PCR-RAPD 10 , 12 , 13 , 15 ( Table 4 ).

Figure 3 . Điện di đồ phân tích DNA hệ gen. M: thang chuẩn DNA 1 kb; 1-18: Các mẫu DNA tổng số tách từ lá cây hoa Hồng, theo thứ tự mẫu nghiên cứu.

Table 4 Nồng độ và chất lượng DNA trích từ lá của 18 giống hoa Hồng

Phân tích đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị PCR-RAPD

Các nghiên cứu về đa hình DNA có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác nhân giống cây trồng vì chúng mang lại cái nhìn sâu sắc hơn về sự đa dạng di truyền 25 . Kết quả phân tích điện di sản phẩm DNA từ PCR-RAPD của 18 mẫu hoa Hồng ghi nhận cả 10 mồi RAPD đều cho các băng đa hình, tổng cộng có 66 băng điện di, trong đó có 58 băng đa hình, đạt 87,88% và 8 băng đơn hình, đạt 12,12%. Số lượng băng trên từng kiểu gen biến thiên từ 5 băng (mồi RAPD-1 và RAPD-4), và mồi cho nhiều băng nhất là 8 băng (RAPD-14), số lượng băng trung bình trên mỗi kiểu gen là 6,6. Kích thước băng lớn nhất khoảng 2000 bp và nhỏ nhất khoảng 200 bp ( Figure 4 ).

Figure 4 . Điện di đồ trên gel agarose 1,5% sản phẩm các phản ứng PCR-RAPD với mồi RAPD-26 trên 18 mẫu hoa Hồng Sa Đéc. M: Khối lượng thang chuẩn DNA 1 kb; 1-18: Sản phẩm PCR-RAPD các mẫu hoa Hồng, theo thứ tự mẫu nghiên cứu.

Phân tích hệ số tương đồng Jaccard của 18 mẫu khảo nghiệm ghi nhận hệ số này nằm trong khoảng từ 0,28 đến 0,72 hay nói cách khác sự khác biệt di truyền giữa các giống hoa Hồng trong khoảng 28 - 72 % ( Table 5 ). Phương pháp UPGMA được sử dụng để phân nhóm các giống hoa Hồng theo sự tương quan di truyền giữa các giống với nhau. Phân tích sơ đồ cây phả hệ, 18 giống hoa Hồng tại Sa Đéc trong nghiên cứu này được phân chia làm 2 nhóm, trong đó chỉ Hồng Trứng Vàng (HTVA) ở nhóm I có bộ gen khác biệt với 17 giống còn lại trong nghiên cứu này (nhóm II). Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng các chỉ thị phân tử trong việc xác định giống bản địa hoặc nguồn gen lạ du nhập vào địa phương và được bảo tồn cho đến thời điểm này.

Nhóm II được chia thành 2 nhóm với 4 nhóm nhỏ và nhiều phân nhánh. Nhóm II.1, ngoại trừ Hồng Dại (HDAI) không có phát hoa tại Sa Đéc, đa số các giống hoa Hồng với đặc trưng dạng hoa cụm, đường kính hoa nhỏ hơn 5 cm, đa số là dạng thân bụi, riêng HPLE và HDAI thuộc dạng thân leo. Nhóm này gồm hai nhóm: II.1A, gồm 3 giống HDAI, HTMD và HTMH; hoa Hồng dại (HDAI) có dạng thân leo và nhiều lông tơ trên phiến lá, còn lại HTMD và HTMH có hình thái hoàn toàn giống nhau ngoại trừ hoa màu đỏ hoặc màu hồng. Với kỹ thuật phân tích, HTMD và HTMH (Hồng tiểu muội đỏ và Hồng tiểu muội hồng) có sự khác biệt di truyền không đáng kể, mức độ tương đồng đạt tới 72%, cao nhất trong tất cả các giống hoa Hồng trong khảo cứu này. Với nhóm II.1B với 4 giống bao gồm HCSO, HTMT, HPLE và HTMN, về cơ bản các giống ở nhóm này có dạng hoa cụm, thân bụi, đường kính hoa nhỏ, ngoại trừ HPLE có dạng thân leo và đường kính hoa lớn; Hồng tiểu muội trắng và tiểu muội nhung trong nhóm này mặc dù có hình thái cây rất giống nhau nhưng vẫn thuộc về hai nhánh khác biệt. Nhóm II.2, với 10 giống chia thành 2 nhóm nhỏ: II.2A với 4 giống bao gồm HLUA, HTHA, HNHX và HTVY với hệ số tương đồng khoảng 42 - 45%; nhóm II.2B với 6 giống Hồng còn lại có hệ số tương đồng khoảng 50 - 54% (bảng 5, Figure 5 ). Về hình thái, có 9 trong 10 giống này dạng thân bụi, ngoại trừ Tường vy (HTVY) dạng thân leo, hoa dạng cụm và đường kính lớn; có 6 giống có hoa dạng đơn, đường kính hoa lớn và 3 giống có dạng hoa cụm, đường kính hoa nhỏ (HBMA, HPHB và HTDO). Theo Mirzaei và cộng sự (2015), cấu trúc di truyền của quần thể thực vật phản ánh sự tương tác của các quá trình khác nhau bao gồm lịch sử tiến hóa lâu dài của loài, sự thay đổi trong phân bố, phân mảnh môi trường sống, cách ly quần thể, đột biến, hệ thống giao phối, chọn lọc tự nhiên… Sự khác biệt về địa lý và sinh thái là nguyên nhân phổ biến trong phân bố đa dạng di truyền trong quần thể 26 . Trong nghiên cứu này, sự đa dạng di truyền của 18 giống hoa Hồng tại Sa Đéc được thể hiện rõ qua sơ đồ phả hệ với sự phân cụm thành nhiều nhóm nhỏ. Sự đa dạng về nguồn gốc di truyền của giống Hồng được khảo sát thể hiện qua chỉ số khoảng cách di truyền sẽ là những cơ sở khoa học bước đầu cho công tác chọn, lai tạo và bảo tồn các giống hoa Hồng tại địa phương.

Table 5 Ma trận hệ số tương đồng của 18 mẫu hoa Hồng được phân tích bằng PCR-RAPD

Figure 5 . Sơ đồ cây phả hệ thể hiện mối quan hệ di truyền giữa 18 giống hoa Hồng Sa Đéc

Để tìm hiểu sự đa dạng di truyền giữa 18 giống hoa Hồng, phân tích tọa độ chính (PCoA) dựa trên dữ liệu hệ số khác biệt di truyền Jaccard được thực hiện. Kết quả cho thấy ba trục tọa độ chính đầu tiên giải thích tổng cộng 59,73% tổng phương sai hệ số khác biệt di truyền, tương ứng trục 1 = 46,69%, trục 2 = 7,32% và trục 3 = 5,72%. Sự phân bố của các kiểu gen qua phân tích PCoA hai chiều cho kết quả tương tự sơ đồ cây phả hệ giữa 18 giống hoa Hồng quan sát ( Figure 6 ). Sự phân bố rời rạc giữa các điểm mẫu trên biểu đồ phân tích tọa độ chính một lần nữa xác thực tính đa hình của các giống hoa Hồng Sa Đéc trong nghiên cứu này thông qua phản ứng PCR-RAPD. Sự đa dạng di truyền giữa các giống hoa Hồng được khảo sát có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn lọc và thiết kế các cặp lai để tạo các giống hoa Hồng mới trong tương lai.

Figure 6 . Biểu đồ phân tích tọa độ chính dựa trên ma trận hệ số tương đồng của 18 giống hoa Hồng

KẾT LUẬN

Trong nghiên cứu này, phân tích mối quan hệ di truyền thông qua các đặc điểm hình thái thực vật và chỉ thị phân tử PCR-RAPD của 18 giống hoa Hồng Sa Đéc đã được thực hiện. DNA bộ gen của toàn bộ các giống hoa Hồng khảo sát được phân lập đảm bảo tính nguyên vẹn và có độ tinh khiết cao. Kỹ thuật PCR-RAPD phù hợp để sử dụng trong đánh giá di truyền ở các giống hoa Hồng Sa Đéc với số lượng băng đa hình cao. Thông qua hệ số tương quan di truyền Jaccard kết hợp sơ đồ cây phả hệ theo phương pháp UPGMA và kết quả phân tích biểu hiện hình thái cho thấy 18 giống hoa Hồng Sa Đéc được chia làm 2 nhóm chính và nhiều phân nhóm nhỏ, trong đó HTVA có bộ gen khác biệt so với 17 giống còn lại trong nghiên cứu này. Công bố này là nghiên cứu đầu tiên về mối quan hệ di truyền giữa các giống hoa Hồng tại làng hoa Sa Đéc, kết quả này có ý nghĩa đặc biệt trong công tác bảo tồn và phát triển nguồn giống trồng tiến tới thiết kế các cặp lai nhằm có thể tạo giống lai mới góp phần công tác phục tráng giống hoa Hồng trong thời gian tới tại tỉnh Đồng tháp.

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu được tài trợ bởi Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG–HCM trong khuôn khổ đề tài cơ sở với mã số T2021-17. Nhóm tác giả cảm ơn Công ty TNHH DTC Phù Sa (phường Tân Quy Đông, thành phố Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp) đã hỗ trợ nguồn vật liệu và tạo điều kiện thuận lợi để thực hiện nghiên cứu này.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

NTSYS: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System

PCoA: Principal Coordinate Analysis

PCR : Polymerase Chain Reaction

RADP : Random Amplified Polymorphic DNA

UPGMA: Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages

UPOV: International Union for the Protection of New Varieties of Plants

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả đồng ý không có bất kì xung đột lợi ích nào liên quan đến các kết quả đã công bố.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Ý tưởng: Phan Ngô Hoang. Thực hiện các thí nghiệm: Nguyễn Thị Kim Anh và Cao Hữu Dụng. Xử lý dữ liệu và viết bản thảo: Lê Anh Tuấn và Nguyễn Thị Kim Anh. Thảo luận, cập nhật hoàn chỉnh bản thảo: Phan Ngô Hoang.

TÍNH KHẢ DỤNG CỦA DỮ LIỆU

Các dữ liệu thô, hình ảnh, bảng kết quả được tạo và phân tích trong nghiên cứu này có sẵn từ tác giả liên hệ đối với các yêu cầu hợp lý.