Open Access 
Abstract
Miliusa velutina (Dun) Hook. f. et. Thoms belongs to the Na family (Annonaceae). In folklore, M.velutina is widely used as a traditional medicine to treat inflammation, scabies, antiseptic, hemostatic, and antibacterial, in addition to being used to kill parasites and as a natural insecticide. Some research on its chemical constituents showed that there are groups of phenols, alkaloids, flavonoids, steroids, acetogenin, sesquiterpenoids, and lactones along with diverse biological activities that help cure cancer, antifungal, antibacterial, antimalarial, antioxidant, antidiabetic. However, in Vietnam, there have not been many studies on M. velutina, so this study was conducted with the aim of investigating the chemical constituents of the M. velutina, somehow providing more data related to the plant. By column chromatography method with thin layer chromatography with different solvent systems from n-hexane extract, five steroids were isolated. The chemical structure of the compounds was elucidated from 1D and 2D-NMR spectroscopic data combined with literature data showing that five steroids were obtusifolione (1), β-sitosterol (2), stigmasterol (3), stigmastan-3-one (4), stigmast-4-en-3-one (5). Among them, three compounds (1), (4) and (5) are first known to exist in the M. velutina.
GIỚI THIỆU
Cây Cò sen ( Miliusa velutina (Dun) Hook. f.et. Thoms) thuộc họ Na (Annonaceae) phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Lào, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam. Ở nước ta, cây mọc hoang ở nơi ẩm như ven suối, trên đất sét pha cát, tiêu biểu ở một số nơi như: An Giang, Lâm Ðồng, Tây Ninh và Bà Rịa – Vũng Tàu. Cây Cò sen đã được lưu truyền sử dụng trong y học dân gian nhằm điều trị viêm xoang, đau dạ dày, lạc huyết, xuất huyết. Bên cạnh đó cây Cò sen còn được dùng để trị một số bệnh ngoài da như ghẻ lở, hắc lào, mụn nhọt 1 . Thành phần hóa học của cây Cò sen gồm các nhóm hợp chất tiêu biểu như alkaloid, sesquiterpen, phenol, steroid, acetogenin... với nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý như kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng sốt rét,… 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Mặc dù vậy, các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của loài Cò Sen còn chưa nhiều. Nội dung bài nghiên cứu trình bày về việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của năm hợp chất steroid: obtusifolione ( 1 ), β -sitosterol ( 2 ), stigmasterol ( 3 ), stigmastan-3-one ( 4 ), stigmast-4-en-3-one ( 5 ) từ cao n -hexane của thân cây Cò sen thu hái tại An Giang.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đối tượng nghiên cứu
Thân cây Cò sen ( Miliusa velutina ) được thu hái tại xã An Phú, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 09 năm 2016 và được định danh bởi Nhà thực vật học Hoàng Việt, Khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh (ĐHQG-HCM).
Một mẫu tiêu bản thực vật (MVE 2016) đã được lưu giữ tại Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM.
Hóa chất và thiết bị
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker Avance 500 (500 MHz cho phổ 1 H NMR và 125 MHz cho phổ 13 C NMR) đo tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM. Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên silica gel 60 F 254 hoặc silica gel 60 RP-18 F 254 S (Merck). Pha sắc ký cột silica gel thường sử dụng silica gel 230-400 mesh RM7484, RP-18(25-40 μ m) (Merck). Thuốc thử hiện vết trên TLC: dung dịch H 2 SO 4 10%; dung dịch vanillin/ethanol 5%. Dung môi hữu cơ dùng trong sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng: n -hexane (HE), chloroform (CF), ethyl acetate (EA), methanol (ME), isopropanol (IPN) được cung cấp bởi hãng Chemsol–Vietnam.
Chiết xuất và phân lập
Thân cây Cò sen khô được nghiền mịn thu được 10,5 kg bột. Tiến hành trích nóng bằng cách đun hoàn lưu lần lượt với từng loại dung môi n -hexane (HE), ethyl acetate (EA) và sau cùng là methanol (ME) thu được các loại cao tương ứng: n -hexane (45,3 g), ethyl acetate (121,0 g) và methanol (593,7 g).
Cao n -hexane (45,3 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi HE:EA có độ phân cực tăng dần (99:1 –0:100) thu được 17 phân đoạn, ( A1 – A17 ). Phân đoạn A5 (619,7 mg) được tiếp tục sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi HE:EA (99:1 –0:100) thu được 3 phân đoạn ( A5.1 – A5.3 ). Phân đoạn A5.3 (363,1 mg) tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi HE:EA (98:2) thu được hợp chất 1 (8,4 mg).
Phân đoạn A6 (644,1 mg) được tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi HE:EA (99:1 – 0:100) thu được 3 phân đoạn ( A6.1 – A6.3 ). Phân đoạn A6.2 (347,9 mg) tiến hành sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi ME:W (90:10) thu được 4 phân đoạn ( A6.2.1−A6.2.4 ). Phân đoạn A6.2.4 (36,3 mg) tiến hành sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi HE:EA (98:2) (giải ly 2 lần) thu được hợp chất 4 (6,7 mg).
Phân đoạn A8 (10,5 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi ME:W (80:20) thu được 5 phân đoạn ( A8.1 – A8.5 ). Phân đoạn A8.3 (1,06 g), tiến hành sắc ký cột silica gel pha thuận, giải ly với hệ dung môi HE:EA (95:5) thu được 4 phân đoạn ( A8.3.1 – A8.3.4 ).
Phân đoạn A8.3.1 (506,7 mg) tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi HE:CF:IPN (95:4,9:0,1) sau đó giải ly với hệ dung môi HE:CF:ME (90:9,8:0,2) thu được hợp chất 5 (68,3 mg).
Phân đoạn A8.4 (416,0 mg) tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi HE:EA (90:10) thu được 3 phân đoạn ( A8.4.1 – A8.4.4 ).
Phân đoạn A8.4.1 (156,7 mg) tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi HE:EA (95:5) thu được hai hợp chất 2 (8,2 mg) và 3 ( 11,2 mg).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Từ cao chiết n -hexane của thân cây Cò sen, tiến hành các phương pháp sắc ký đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của năm hợp chất như trong Figure 1 cùng dữ liệu phổ NMR được trình bày trong Table 1 . Thông tin về năm hợp chất như sau:
Hợp chất 1 dạng rắn vô định hình, không màu, tan tốt trong chloroform. Phổ 1 H-NMR trong vùng δ H 0,7 – 1,2 có bảy tín hiệu proton methyl tại vị trí δ H 0,93 (3H, d , J= 6,4 Hz, H-21), 1,02 (6H, d , J= 6,8 Hz, H-30, H-27), 1,03 (3H, d , J= 6,8 Hz, H-26), 0,74 (3H, s , H-18), 0,88 (3H, s , H-32) và 1,19 (3H, s , H-19). Có hai mũi tín hiệu của proton olefin tại vị trí δ H 4,66 (1H, q , J = 1,5 Hz, H-28a) và 4,72 (1H, s , H-28b). Phổ 13 C-NMR cho thấy có 30 carbon, trong đó có một carbon carbonyl tại vị trí δ C 213,7 (C-3), bốn mũi tín hiệu của carbon sp 2 tại vị trí δ C 106,1 (C-28), 157,0 (C-24), 132,6 (C-9) và 135,8 (C-8). Hai mươi lăm tín hiệu carbon còn lại là tín hiệu carbon sp 3 của các nhóm methine, methylene, methyl trong vùng δ C 10 – 55. Tương quan HSQC giữa proton tại vị trí δ H 4,66 (1H, q , J = 1,5 Hz, H-28a) và 4,72 (1H, s , H-28b) với carbon olefin tại vị trí δ C 135,8 (C-8) cho thấy có một nối đôi đầu mạch. goài ra phổ HMBC cho thấy có tương quan giữa hai proton này với carbon olefin tại vị trí δ C 157,0 (C-24) ( Figure 2 ). Từ các dữ liệu phổ trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo 8 cấu trúc hóa học hợp chất 1 được đề nghị là obtusifolione .
Hợp chất 2 dạng bột màu trắng, tan tốt trong chloroform. Phổ 1 H-NMR cho thấy có 6 tín hiệu proton methyl đặc trưng của khung steroid loại stigmastane tại δ H 1,01 (3H, s , H-29), 0,68 (3H, s , H-28), 0,81 (3H, d , J= 7,2 Hz, H-27), 0,92 (3H, d , J= 6,7 Hz, H-19), 0,84 (3H, d , J= 6,8 Hz, H-26) và 0,84 (3H, t , J= 8,0 Hz, H-24). Bên cạnh đó, có 1 tín hiệu của proton olefin δ H 5,35 (1H, m , H-6) và 1 tín hiệu proton oxymethine tại δ H 3,53 (1H, tt , J = 10,7; 4,7 Hz, H-3). Phổ 13 C-NMR cho thấy có tất cả 29 tín hiệu cộng hưởng, trong đó có 2 tín hiệu của carbon olefin tại 𝛿 C 140,9 (C-5) và 121,9 (C-6). Tín hiệu tại 𝛿 C 72,0 (C-3) là của carbon có gắn dị nguyên tố. Tín hiệu còn lại của 26 carbon sp 3 thuộc các nhóm methine, methylene và methyl tại δ C 10–55. Từ các dữ liệu phổ trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo 9 cấu trúc hóa học hợp chất 2 được đề nghị là β -sitosterol.
Hợp chất 3 dạng bột vô định hình, màu trắng, tan tốt trong chloroform. Phổ NMR của hợp chất 3 tương tự như hợp chất 2 với khung steroid loại stigmastane ngoại trừ sự khác biệt là ở hợp chất 3 có thêm hai tín hiệu proton olefin ở δ H 5,02 (1H, dd , J = 15,2; 8,7 Hz, H-20), 5,16 (1H, dd , J = 15,2; 8,6 Hz, H-21) tương ứng với hai tín hiệu carbon olefin ở δ C 138,5 (C-20) và 129,5 (C-21). Từ các dữ liệu phổ trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo 9 cấu trúc hóa học hợp chất 3 được đề nghị là stigmasterol.
Figure 1 . Cấu trúc năm hợp chất steroid được phân lập từ thân cây Cò sen ( Miliusa velutina )
Hợp chất 4 dạng rắn vô định hình, không màu, tan tốt trong chloroform. Phổ 1 H-NMR cho thấy có 6 tín hiệu proton methyl tại vị trí δ H 0,91 (3H, d , J= 6,5 Hz, 3H, H-19), 0,81 (3H, d , J= 6,8 Hz, H-27), 0,83 (3H, d , J= 6,8 Hz, H-26), 0,68 (3H, s , H-29), 1,01 (3H, s , H-28), 0,85 (3H, t , J= 7,5 Hz, H-24) đặc trưng cho khung steroid loại stigmastane. Phổ 13 C-NMR cho thấy 29 carbon, trong đó có một carbon carbonyl tại vị trí δ C 212,4 (C-3). Hai mươi tám tín hiệu carbon còn lại là các carbon sp 3 trong vùng δ C 10 – 55. Kết hợp với phổ proton có thể kết luận đây là một steroid khung stigmastane mang một nhóm ketone. Từ các dữ liệu phổ trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo 10 cấu trúc hóa học hợp chất 4 được đề nghị là stigmastan-3-one.
Hợp chất 5 dạng tinh thể hình kim màu trắng, tan tốt trong chloroform. Phổ NMR của hợp chất 5 tương tự như hợp chất 4 với khung steroid loại stigmastane ngoại trừ sự khác biệt ở một tín hiệu proton olefinic ở δ H 5,72 (1H, , H-4) tương ứng với hai tín hiệu carbon olefin ở δ C 123,9 (C-4) và 171,8 (C-5). Từ các dữ liệu phổ trên kết hợp so sánh tín hiệu với tài liệu tham khảo 11 cấu trúc hóa học hợp chất 5 được đề nghị là stigmast-4-en-3-one.
KẾT LUẬN
Từ cao n -hexane của thân cây Cò sen ( Miliusa velutina ), tiến hành các phương pháp thường qui trong lãnh vực hóa học các hợp chất tự nhiên, kết hợp với các phương pháp hóa lý hiện đại cùng với tra cứu tài liệu tham khảo, đã phân lập và xác định cấu trúc năm hợp chất steroid bao gồm: obtusifolione (1) , β -sitosterol ( 2 ), stigmasterol ( 3 ), stigmastan-3-one ( 4 ), stigmast-4-en-3-one ( 5 ). Hai hợp chất (2) và (3) đã từng được tìm thấy trong hoa và quả cây Cò sen 12 , ba hợp chất (1) , (4) và (5) lần đầu tiên được tìm thấy trong loài Cò sen.
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh trong khuôn khổ Đề tài mã số 562-2022-18-05 .
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
1 H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance
13 C-NMR: Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance
HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy
HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation
s: Mũi đơn (singlet)
d: Mũi đôi (doublet)
dd: Mũi đôi-đôi (doublet of doublets)
m: Mũi đa (multiplet)
t: Mũi ba (triplet)
HE: n -Hexane
CF: Chloroform
EA: Ethyl acetate
IPN: Isopropanol
ME: Methanol
W: Nước
XUNG ĐỘT LỢI ÍCH
Nhóm tác giả cam kết không có bất kỳ xung đột lợi ích trong nghiên cứu và công bố này.
ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ
Tất cả tác giả đều tham gia, đóng góp vào việc tư vấn, thiết kế quy trình thí nghiệm, thực hiện thí nghiệm; tổng hợp và xử lý các kết quả, dữ liệu thu được từ các phương pháp phổ nghiệm.
Thực hiện viết bản thảo: Bùi Ngọc Phúc. Tôn Thất Quang chỉnh sửa, hoàn chỉnh và duyệt bản thảo cuối với sự đồng thuận của tất cả các tác giả.
References
- Hộ P.H.. Cây cỏ Việt Nam Nhà xuất bản trẻ, 1-1027, 1999. . ;:. Google Scholar
- Hasan CM, Jumana S, Rashid MA. (+)-Isocorydine α- N −Oxide: a New Aporphine Alkaloid from Miliusa velutina. Nat Prod Lett. 2000;14(5):393-7. . ;:. Google Scholar
- Jumana S, Hasan CM, Rashid MA. Alkaloids from the stem bark of Miliusa velutina. Biochem Syst Ecol. 2000;28(5):483-5. . ;:. PubMed Google Scholar
- Nguyen DMT, Vo TN, Ton TQ, Nguyen KPP. Alkaloids from Miliusa velutina. Viet J Chem. 2015;53:85-8. . ;:. Google Scholar
- Ton TQ, Vo TN, Nguyen DMT, Nguyen TTV, Nguyen KPP. Phenolic compounds from Miliusa velutina. Viet J Chem. 2017;55:216-20. . ;:. Google Scholar
- Vo Van NTT, TKL, Dang PH, Ngoc VH, Ngo TTD, Nguyen TM-N et al. Two new sesquiterpenes from the stems of Miliusa velutina. Nat Prod Res. 2020;36:553-9. . ;:. PubMed Google Scholar
- Wongsa N, Kanokmedhakul S, Kanokmedhakul K. Cananginones A-I, linear acetogenins from the stem bark of Miliusa velutina. Phytochemistry. 2011;72(14-15):1859-64. . ;:. PubMed Google Scholar
- Shirane N, Murabayashi A, Masuko M, Uomori A, Yoshimura Y, Seo S et al. Effect on ergosterol biosynthesis of a fungicide, SSF-109, in Botrytis cinerea. Phytochemistry. 1990;29(8):2513-20. . ;:. Google Scholar
- Chaturvedula VSP, Prakash I. Isolation of stigmasterol and β-sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus. Int Curr Pharm J. 2012;1(9):239-42. . ;:. Google Scholar
- Luo J, Ma Q, Zhao Y, Yi T, Li C, Zhou J. Palaeophytochemical components from the Miocene-fossil wood of Pinus griffithii. J Chin Chem Soc. 2009;56(3):600-5. . ;:. Google Scholar
- Barla A, Birman H, Kültür Ş, Öksüz S. Secondary metabolites from Euphorbia helioscopia and their vasodepressor activity. Turk J Chem. 2006;30(3):325-32. . ;:. Google Scholar
- Promgool T, Kanokmedhakul K, Tontapha S, Amornkitbamrung V, Tongpim S, Jamjan W et al. Bioactive homogentisic acid derivatives from fruits and flowers of Miliusa velutina. Fitoterapia. 2019;134:65-72. . ;:. PubMed Google Scholar
