VNUHCM Journal of

Natural Sciences

An official journal of Viet Nam National University Ho Chi Minh City, Viet Nam

ISSN 2588-106X

Skip to main content Skip to main navigation menu Skip to site footer

 Review

HTML

162

Total

82

Share
Protein display on lactic acid bacteria cell surface






 Open Access  

Downloads

Download data is not yet available.

Abstract

The strong development of novel protein expression systems, especially in lactic acid bacteria, has attracted a lot of attention and presented many challenges for scientists, not only in terms of safety but also in the ability to preserve food. With the advantage of possessing a rigid cell wall structure and typical acid resistance, lactic acid bacteria have become a potential target not only as a cell factory for producing recombinant proteins used in the food industry but also as a means of delivering antigens for mucosal vaccine development. To achieve this goal, a series of target protein expression systems have been developed in many lactic acid bacteria. This review summarizes recent developments in foreign protein expression systems in both secretion and surface display forms in lactic acid bacteria, including prominent examples such as Lactococcus lactis and Lactobacillus plantarum, as well as current research on developing promising promoter systems to not only improve their ability but also increase their expression efficiency on the surface of lactic acid bacteria.

GIỚI THIỆU

Vi khuẩn lactic acid (lactic acid bacteria, LAB) thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương được công nhận an toàn GRAS (Generally Recognized As Safe), thường được ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, đã và đang thu hút sự chú ý trong quá trình nghiên cứu và phát triển hệ thống biển hiện protein an toàn cấp thực phẩm (food-grade expression system) 1 . LAB thường được tìm thấy trong nhiều dạng môi trường sống tự nhiên như khoang miệng, đường sinh dục, đường tiêu hóa của người và động vật, hoặc sản phẩm lên men của sữa, thịt và rau củ 2 và đã được sử dụng suốt một thời gian dài trong quá trình chế biến các loại thực phẩm. LAB bao gồm một số loài trong các chi Lactococcus , Lactobacillus , Enterococcus , và Streptococcus có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí lẫn hiếu khí và lên men đường hexose để sản xuất lactic acid như sản phẩm chính cuối cùng 3 . Quá trình acid hóa khi sản xuất lactic acid là lý do chính cho tác dụng bảo quản của LAB nhằm ức chế sự phát triển của vi sinh vật thường gây hư hỏng thực phẩm 4 . LAB cũng có thể sản xuất ra các bacteriocin, là các peptide kháng khuẩn, có khả năng ức chế sự phát triển của mầm bệnh cạnh tranh 5 , 6 . Nhiều LAB như Lactobacillus spp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp. đã được công nhận là vi sinh vật có khả năng tăng cường sức khỏe cho đường tiêu hóa của vật chủ, hay còn được gọi là lợi khuẩn. Một ứng dụng tốt khác của lợi khuẩn LAB là kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ. Cụ thể, L. casei Shirota đã cải thiện tình trạng viêm đại tràng ở chuột bằng cách ức chế chuyển vị của NF-κB và sản xuất IL-6 7 . Thành phần chưa được xác định của vi khuẩn L. paracasei Ncc2461 đã cảm ứng các tế bào T CD4 + trong lách chuột, tạo ra IL-10 và TGF-β 8 . Gần đây, Florin Barla và cộng sự 9 đã ghi nhận việc sử dụng LAB từ thực phẩm lên men truyền thống của tỉnh Ishikawa để sản xuất γ-aminobutyric acid (GABA) có tác dụng hạ huyết áp. Ngoài ra, LAB được chứng minh giúp giảm cholesterol và hydrolase muối mật 10 .

Với những lợi ích trên, LAB là đối tượng tiềm năng trong các ứng dụng liên quan đến thực phẩm chức năng để cộng sinh/cạnh tranh với một số loài vi khuẩn và nấm khác như Escherichia coli , Bacillus subtilis , B. licheniformis , Aspergillus oryzae hoặc A. niger dùng để sản xuất các sản phẩm tự nhiên và tái tổ hợp 11 . Ngoài ra, nhờ đặc tính cấu trúc cứng của thành tế bào và khả năng kháng acid cao của vi khuẩn Gram dương, nên LAB có tiềm năng được ứng dụng làm xúc tác sinh học toàn tế bào và làm phương tiện vận chuyển kháng nguyên để phát triển vaccine đường niêm mạc. Với mục đích này, một loạt các gene được biểu hiện như là hệ thống protein nhắm trúng đích đã được phát triển trong nhiều LAB 12 .

Các thuộc tính của những hệ thống biểu hiện này và các ứng dụng hiện tại hoặc tiềm năng đã và đang được nhắm đến chủ yếu ở Lactococcus lactis và Lactobacillus plantarum , là hai loài LAB được nghiên cứu nhiều nhất cho các ứng dụng này. Phần tổng quan này có thảo luận về cấu trúc, chức năng và tình hình nghiên cứu cho đến thời điểm hiện tại của các hệ thống tiết protein qua màng và biểu hiện protein ngoại lai ở vi khuẩn Gram dương nói chung và LAB nói riêng.

Table 1 Một số protein đã được biểu hiện trên bề mặt tế bào LAB

CƠ CHẾ TIẾT PROTEIN QUA MÀNG TẾ BÀO CHẤT Ở LAB

Các hệ thống tiết và đích đến cuối cùng của các protein ở vi khuẩn Gram dương

Protein tái tổ hợp có thể được sản xuất trong tế bào chất hoặc được vận chuyển qua màng và xuất trực tiếp ra môi trường, hoặc được đính trên bề mặt vi khuẩn 3 . Một số cơ chế khác nhau để vận chuyển protein đã được ghi nhận. Ở vi khuẩn Gram dương, bảy cơ chế chính để tiết protein đã được mô tả như Twin-arginine translocation (Tat pathway), Flagella export apparatus (FEA pathway), WXF100 secretion system (Wss pathway), Fimbrillin-protein exporter (FPE pathway), Peptide efflux ABC-transporters, Holin-system, và tiết thông qua con đường Sec (Sec pathway) ( Figure 1 ) 2 . Trong đó, protein được tiết ra có thể: (i) Được neo vào màng tế bào (lipoprotein); (ii) Được gắn vào vách tế bào (cell wall/CW) hoặc bằng liên kết cộng hóa trị (protein LPxTG) hoặc không cộng hóa trị (bằng cách biển hiện các motif LysM, GW, CWBD2, SLHD hoặc WXL); (iii) Là một phần của các cấu trúc phụ trên bề mặt tế bào như cellulosome hoặc lông nhung (các tiểu đơn vị được tiết ra qua Sec), pseudo-pili (được lắp ráp thông qua FPE) hoặc tiên mao (được lắp ráp thông qua FEA); (iv) Được tiết ra ngoại bào thông qua Sec, Tat, holin hoặc Wss; hoặc (v) Được chuyển vào tế bào chủ sau khi tiết thông qua Sec của cytolysin phụ thuộc vào cholesterol, được sáp nhập vào màng plasmatic của tế bào chủ và sau đó cho phép chuyển các chất tiết ra bằng quá trình dịch mã qua trung gian cytolysin (CMT).

Figure 1 . Các hệ thống tiết và đích đến cuối cùng của các protein được tiết ra ở vi khuẩn Gram dương 18 . Mũi tên đen biểu thị protein có đích đến là màng tế bào mang peptide tín hiệu ở đầu N. Mũi tên xanh là con đường tiết qua màng ở các protein thiếu peptide tín hiệu. Mũi tên đỏ là các con đường tiết. Mũi tên tím là con đường gắn vào màng lipid kép ở protein màng (IMP). Protein màu xanh là các protein tiết qua màng. Chữ viết tắt: Cyto, tế bào chất; CM, màng tế bào chất; CW, vách tế bào; OM, màng ngoài; Ext, ngoại bào 18 .

Figure 1 .

[Download figure]

Gần đây, con đường Tat ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ được chứng minh là con đường dùng để vận chuyển các protein ở dạng gấp cuộn hoàn toàn với một motif twin-arginine được bảo tồn cao có chứa peptide tín hiệu 19 . Con đường FEA vốn có liên quan đến sự chuyển vị của các thành phần trong tế bào vi khuẩn Gram dương, nhưng cũng được sử dụng để tiết các yếu tố độc lực ra ngoại bào ở vi khuẩn Gram dương 20 . Một hệ thống tiết chuyên biệt khác được xác định ở vi khuẩn Gram dương là con đường Wss, liên quan đến sự vận chuyển của họ protein WXG100 (ESAT-6) 21 . Con đường FPE có vai trò trong sự chuyển vị của các tiền chất liên quan đến sự phát triển của vi khuẩn khi cho phép nhập bào DNA ngoại lai qua màng tế bào 18 . Holin là các protein sáp nhập xuyên màng nhỏ tạo thành một hệ thống tiết chuyên biệt chỉ có ở vi khuẩn Gram dương 21 . Hệ thống holin có liên quan đến hoạt động tiết của hydrolase murein vốn thiếu peptide tín hiệu và đóng vai trò quan trọng trong quá trình tự phân giải. Con đường Sec là con đường tiết protein chủ yếu ở vi khuẩn Gram dương, sử dụng các peptide tín hiệu ở đầu N với các tính năng được bảo tồn ở vi khuẩn Gram dương. Nhờ công cụ tìm kiếm trình tự tương đồng và domain của protein, bộ gene của Lactobacillus đã được chứng minh có chứa các gene mã hóa cho các hệ thống Sec, FPE, holin và không mã hóa cho các yếu tố quan trọng có liên quan đến con đường tiết protein Tat, FEA và Wss 2 .

Vai trò của peptide tín hiệu trong cơ chế tiết protein qua màng ở LAB

Peptide tín hiệu (signal peptide, SP), có vai trò trong sự vận chuyển qua màng tế bào chất ở phần lớn các protein tiết, có cấu trúc gồm 3 domain riêng biệt là N, H và C, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển vị và tiết của protein 22 . Một arginine hoặc lysine bảo tồn có trong domain ở đầu N được sử dụng để tương tác với động cơ chuyển vị và phospholipid tích điện âm trong màng lipid kép của màng. Vùng kỵ nước bảo tồn cũng như glycine hoặc proline bảo tồn ở giữa lõi kỵ nước của vùng H (vùng phá xoắn bảo tồn) có thể tạo thành cấu trúc giống kẹp tóc hỗ trợ cho sự chèn vào màng. Vùng phá xoắn bảo tồn có thể được tách ra nhờ vai trò của peptidase tín hiệu (signal peptidase, SPase): vị trí phân tách trên domain ở đầu C của SP được nhận diện bởi một SPase đặc hiệu giúp cắt SP ra khỏi phần còn lại, trở thành protein tiết được vận chuyển qua màng tế bào chất. Mặc dù các SP có cấu trúc tương tự nhau, nhưng các biến thể nhỏ ở các SP khác nhau quyết định đích vận chuyển đến các điểm đến khác nhau hoặc xuất qua các con đường khác nhau 23 . Dựa trên các phân tích trình tự của SP và protein nhận biết của chúng, bốn đặc tính đã được chứng minh có mối tương quan với chức năng của SP là tính kỵ nước cao, sự hiện diện của chuỗi xoắn xuyên màng, sự vắng mặt của một motif neo trong protein nhận biết và độ dài của domain H+C 24 . Những thay đổi về tính kỵ nước của vùng lõi của SP và chiều dài của SP đã được chứng minh là ảnh hưởng đến hiệu quả tiết ở vi khuẩn Gram dương 25 . Ngoài sự phụ thuộc cao vào SP, hiệu quả tiết được phát hiện có tính đặc hiệu cao với vật chủ và phụ thuộc vào tính chất của protein mục tiêu như kích thước hoặc mức độ biểu hiện nội bào của chúng 24 , 25 , 26 , 27 , 28 . L. lactis đã được chứng minh có thể tiết ra các protein từ 10 đến 160 kDa thông qua con đường phụ thuộc Sec 29 . Mức sản xuất cao của protein mục tiêu có thể gây ra tình trạng quá tải động cơ chuyển vị, từ đó dẫn đến hiệu quả tiết thấp 24 . Do đó, sự kết hợp tối ưu giữa SP và protein mục tiêu mong muốn là điều cần thiết và thiết yếu để có thể đạt được hiệu quả tiết cao. Một số vi khuẩn Gram dương có khả năng tiết ra protein với hiệu suất khá cao. Các mô hình trên vi khuẩn Gram dương như B. subtilis , L. lactis và L. plantarum đã được nghiên cứu kỹ về tiềm năng dùng trong sản xuất protein ngoại lai ở dạng tiết 25 , 26 .

Usp45 là SP được khai thác rộng rãi nhất ở LAB biến đổi gene ở Lactococcus 28 . Các SP dị loài khác đã được sử dụng để tiết các protein ngoại lai trong L. plantarum bao gồm SP từ Streptococcus pyogenes là protein M6, từ L. amylovious là amylase, và từ L. brevis là protein S-layer (SlpA). Geir Mathiesen (2008) đã thử nghiệm các SP tương đồng từ L. plantarum WCFS1 và so sánh chức năng của chúng trong quá trình tiết hai mô hình protein ngoại lai khác nhau (NucA từ Staphylococcus aureus và AmyA từ L. amylovorus ) 30 . Trong nghiên cứu này, hệ thống pSIP cảm ứng biểu hiện dựa trên pheromone peptide trong Lactobacillus đã được sử dụng 31 và hiệu quả tiết của các SP này đã được so sánh với hai SP (ngoại lai) nổi tiếng Usp45 và M6. Kết quả cho thấy 4 trong số 10 trình tự được chọn có vị trí phân cắt là Ala-X-Ala-Ala, nhưng chúng không đạt hiệu quả tiết cao. Hai SP từ L. plantarum là Lp-0373 và Lp-0600, vốn có trình tự motif là Val-X-Ala ở vị trí -3 đến -1 so với vị trí phân cắt, là các SP hoạt động tốt nhất để tiết nuclease và amylase 30 . Trong một nghiên cứu khác, Karlskes và đồng nghiệp cũng chỉ ra rằng ba SP có nguồn gốc từ Lp-3050, Lp-0373 và Lp-2578 cho thấy mức độ sản xuất và hiệu quả tiết của nuclease NucA ở năm loài Lactobacillus bao gồm L. rhamnosus , L. brevis , L. gasseri , L. curvatus và L. plantarum khá khác nhau; trong đó SP có nguồn gốc từ Lp-3050 cho lượng NucA tiết ra cao nhất 32 . Kết quả này cho mỗi sự kết hợp giữa chủng chủ và protein mục tiêu có thể cần phải được tối ưu hóa riêng biệt.

CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN PROTEIN TRÊN BỀ MẶT Ở LAB

Việc biểu hiện các protein ngoại lai trên bề mặt tế bào vi khuẩn là một chiến lược hấp dẫn cho nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ sinh học, điều trị bệnh và công nghiệp như phát triển vaccine sống, sản xuất kháng thể, xúc tác sinh học toàn tế bào, hấp thụ sinh học và cảm biến sinh học 33 . Một số protein đã được biểu hiện trên bề mặt tế bào LAB được trình bày ở Table 1 .

Một trong những tính năng hấp dẫn nhất của nghiên cứu biểu hiện trên bề mặt tế bào là việc các protein mục tiêu dung hợp với các motif neo vốn được đồng thời vừa tổng hợp vừa cố định trên bề mặt tế bào vi khuẩn; kết quả là dễ dàng thu nhận được protein mục tiêu từ các tế bào vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy. Trong cách tiếp cận này, các tế bào tự thực hiện toàn bộ quy trình phức tạp gồm nhiều phản ứng ở nhiều bước vốn tốn nhiều năng lượng và thời gian, do đó mang lại lợi ích lớn về mặt kinh tế. Ngoài ra, các protein ngoại lai neo trên bề mặt của tế bào vi khuẩn có tính ổn định cũng như khả năng bảo toàn trong điều kiện khắc nghiệt cao hơn nhiều lần so với protein tự do, đặc biệt là khi protein được chèn vào thành của tế bào vi khuẩn 34 . Điều này có nghĩa chiến lược biểu hiện protein trên bề mặt cần được cân nhắc, phân tích kỹ lưỡng và lựa chọn hợp lý, đủ cao để cải thiện khả năng tiếp cận của protein với các đích đến của chúng và đủ thấp để bảo vệ các protein được biểu hiện trên bề khỏi bị phân hủy 3 . Mặt khác, mức độ biểu hiện của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm protein mục tiêu, chủng chủ và các loại neo được sử dụng. Một protein mục tiêu tự nó cũng có ảnh hưởng đến quá trình dịch mã và biểu hiện lên bề mặt. Kích thước quá lớn hoặc mức độ biểu hiện quá cao của protein mục tiêu có thể dẫn đến tiết không hiệu quả, điều này có thể làm giảm sự tăng trưởng của vật chủ tái tổ hợp và lượng thấp protein biểu hiện trên bề mặt của nó 35 . Các protein mục tiêu khác nhau được dung hợp vào cùng một loại neo sẽ được chuyển đến các vị trí khác nhau trong cùng một chủng chủ 36 . Rõ ràng, việc lựa chọn chủng chủ để sử dụng có vai trò cực kỳ quan trọng trong chiến lược biểu hiện trên bề mặt. Một chủng chủ tốt phải phù hợp với “protein đi theo/passenger protein”, dễ dàng nuôi cấy mà không cần ly giải tế bào và hoạt tính protease ngoại bào và protease tương ứng của thành tế bào thấp. Xem xét điểm này, vi khuẩn Gram dương dường như là sự lựa chọn thuận lợi hơn là vi khuẩn Gram âm vì chúng có cấu trúc thành tế bào khá cứng 34 và chỉ có một màng kép thuận lợi cho protein đi xuyên qua 35 . Các neo chứa một SP hiệu quả để xuất protein mục tiêu qua màng trong. Một cấu trúc neo ổn định cũng như chiều dài và trình tự của neo nên được cân nhắc để có thể giữ được protein dung hợp trên bề mặt tế bào mà không bị tách ra. Ngoài việc tương thích với các chuỗi ngoại lai được dung hợp, neo còn có khả năng chống lại sự tấn công của các protease có mặt trong không gian chu chất hoặc trong môi trường nuôi cấy. Tất cả các lưu ý cần thiết được đề cập ở trên gợi ý rằng sự hiểu biết sâu về chức năng của neo có thể có ích cho việc tối ưu hóa hệ thống biểu hiện trên bề mặt. Về nguyên tắc, có hai cách khác nhau để gắn protein được tiết ra lên trên bề mặt của vi khuẩn là thông qua liên kết cộng hóa trị với màng tế bào hoặc thành tế bào và liên kết không cộng hóa trị thông qua protein domain tương tác mạnh với các thành phần của thành tế bào hoặc màng ( Figure 2 ). Cả hai hệ thống này đã được sử dụng trong LAB, chủ yếu ở L. lactis và các lactobacilli khác nhau.

Figure 2 . Các phương pháp dùng để biểu hiện protein lên bề mặt tế bào Lactobacillus 37

Figure 2 <a class=37" width="300" height="200">

[Download figure]

Neo không cộng hoá trị

Neo không cộng hoá trị

Neo không cộng hoá trị

Neo cộng hoá trị

Neo cộng hoá trị

Neo cộng hoá trị

PHÁT TRIỂN CÁC PROMOTOR BIỂU HIỆN THƯỜNG TRỰC Ở LAB

Như đã đề cập ở trên, việc phát triển các công cụ di truyền để sản xuất protein và enzyme ngoại lai trong LAB đang rất được quan tâm. Một số các hệ thống vector biểu hiện cảm ứng đã được phát triển trong LAB. Các vector pSIP dựa trên promoter cảm ứng mạnh P sppA vốn dành riêng cho chủng chủ Lactobacillus , đã được chứng minh là cung cấp mức độ biểu hiện cao, kiểm soát chặt chẽ bằng lượng nano gram được thêm vào của tác nhân cảm ứng là peptide cảm ứng (induction peptide, IP). Nhìn chung, hệ thống vector biểu hiện cảm ứng hữu ích trong trường hợp cần phải đạt được mức sản xuất tối đa của protein tái tổ hợp tại một thời điểm nhất định và cụ thể của quá trình nuôi cấy, hoặc khi protein có tác động tiêu cực đến quá trình chuyển hóa tế bào vi khuẩn 66 . Ngoài ra, ngày càng có nhiều sự quan tâm đối với sự phát triển của LAB với vai trò là nhà máy sản xuất tại chỗ hoặc là phương tiện phân phối các hợp chất điều trị hoặc enzyme trong cơ thể người, nhưng điều này khiến cho hệ thống biểu hiện cảm ứng không còn phù hợp 67 . Đối với các ứng dụng này, chiến lược sử dụng các vector biểu hiện thường trực liên quan đến sản xuất protein ở mức mong muốn sẽ là một giải pháp thay thế khả thi. Đáng chú ý là các promoter vi khuẩn có chung đặc tính có thể có tác động và cường độ khác nhau trong LAB; do đó, cần thiết phải xác định, đánh giá các promoter và kiểm tra tính hiệu quả của các hệ thống vector biểu hiện khác nhau cho mỗi vật chủ mới 68 . Nhìn chung, có ba chiến lược chính để tìm kiếm và xác định các promoter có nguồn gốc từ L. lactis và các LAB khác hiện hữu bao gồm: (a) Sử dụng các vector sàng lọc mang promoterless reporter genes; (b) Phân lập các promoter từ các gene house-keeping mạnh và thường trực; (3) Tạo ra các promoter tổng hợp từ các consensus promoter 12 . Rud và cộng sự đã phát triển một thư viện promoter tổng hợp (synthetic promoter library, SPL) cho L. plantarum dựa trên cách tiếp cận của Jensen & Hammer, trong đó một thư viện các promoter nhân tạo cho L. lactis thu được bằng cách sắp xếp ngẫu nhiên spacer sequence vốn phân tách các consensus sequences của promoter. SPL thu được đã cung cấp một loạt các promoter thường trực sở hữu các thế mạnh khác nhau trong sản xuất ổn định protein; và các promoter mạnh nhất, điển hình là P 11 , đã mang lại sản lượng protein tương đương với native rRNA promoters 67 . Tauer và đồng nghiệp 66 đã so sánh chức năng của bốn promoter thường trực bao gồm P 11 , P tuf33 , P tuf34 và P efp và kiểm tra biểu hiện trong tế bào chất của gene mCherry với mục đích cung cấp một hệ thống thường trực phù hợp cho các ứng dụng trong lên men thực phẩm hoặc phân phối thuốc trong điều kiện in vivo . Promoter P 11 được đánh giá là promoter mạnh nhất. Việc biểu hiện cũng đạt được kết quả tốt khi sử dụng cả hai promoter mới là P tuf33 và P tuf34 , hiện có sẵn dưới dạng các yếu tố bổ sung để thúc đẩy quá trình biểu hiện thường trực trong L. plantarum và L. buchneri trong khi promoter P efp cho hiệu quả rất yếu. Do đó, việc đánh giá độ mạnh của các promoter thường trực này có thể có ích cho sự phát triển các hệ thống biểu hiện thường trực trong LAB, từ mức độ sản xuất trung bình cho đến mạnh.

Trong một nghiên cứu gần đây, ảnh hưởng của ba promoter thường trực là pgm, slpA và slpB đến biểu hiện dạng tiết và biểu hiện trên bề mặt của gene manB trong chủng chủ L. plantarum đã được tiến hành so sánh. Những promoter thường trực này được đánh giá là yếu tố tiềm năng cho khả năng biểu hiện trong nội bào của các protein ngoại lai trong lactobacilli. Promoter cho đột biến phosphoglycerate (phosphoglycerate mutase, pgm) là một promoter thường trực mạnh có nguồn gốc từ L. acidophilus NCFM, vốn là một chủng lợi khuẩn đã có lịch sử được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng, các sản phẩm từ sữa và sữa công thức cho trẻ sơ sinh ( Figure 4 ) 66 , 47 . Promoter pgm được xác định dựa trên phân tích bộ gene đã chứng minh một số operon biểu hiện khác biệt để đáp ứng với các nguồn carbohydrate hoặc biểu hiện thường trực bất kể nguồn carbohydrate 69 . Tri Duong và cộng sự đã phát hiện ra mức độ biểu hiện của GUS, vốn chịu kiểm soát bởi promoter thường trực pgm , cao xấp xỉ 10 lần so với mức biểu hiện trong cấu trúc cảm ứng ở hai chủng chủ là L. acidophilus và L. gasseri . Promoter đã có thể điều khiển biểu hiện của operon oxalate, cải thiện đáng kể quá trình phân hủy oxalate của L. gasseri ATCC 33323. Kết quả này cho thấy việc sử dụng một hệ thống vector biểu hiện thường trực dựa trên promoter pgm có thể là một công cụ hữu ích để biểu hiện vượt mức các protein và enzyme mong muốn trong lactobacilli và các chủng khác của LAB.

Figure 4 . Vùng trình tự gốc của promoter pgm (69)

Figure 4 (69)

[Download figure]

Promoter slpA của L. acidophilus ATCC 4356 đã được nghiên cứu rộng rãi trong phát triển các hệ thống biểu hiện gene ngoại lai trong một loạt các chủng chủ Lactobacillus . Promoter slpA đã được chứng minh là có hiệu quả cao không chỉ trong chủng chủ tự nhiên mà còn trong cả chủng L. casei ATCC 393, vốn không sở hữu S-layer protein 68 , 48 . Đáng chú ý, vùng promoter của vị trí biểu hiện gene slpA từ L. acidophilus bao gồm hai promoter tiềm năng là P-1 (vị trí -228 đến -198) và P-2 (vị trí -335 đến -303) ( Figure 5 ). Kết quả này cho thấy lượng mRNA được định hướng bởi một cấu trúc nhiều promoter có thể cao hơn so với khi chỉ được định hướng của một promoter 48 .

Figure 5 . Trình tự nucleotide trước khi bắt đầu dịch mã gene slpA của chủng L. acidophilus hoang dại ATCC 4356 (48)

Figure 5 hoang dại ATCC 4356 (48)

[Download figure]

KẾT LUẬN

Bài báo này trình bày tổng quan về các hệ thống biểu hiện protein ngoại lai ở dạng tiết và biểu hiện trên bề mặt của LAB, và một số giải pháp nhằm tăng hiệu quả biểu hiện của chúng. Mặc dù có rất nhiều tiềm năng đã và đang được chứng minh, nhưng thực tế là để có thể áp dụng phổ biến các hệ thống biểu hiện ở LAB, các nhà khoa học cần phải có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn với hy vọng rằng trong tương lai, các nghiên cứu này sẽ có thêm nhiều đột phá nhằm đưa ứng dụng của các chúng đến tất cả các lĩnh vực của cuộc sống con người.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

LAB: Lactic Acid Bacteria

GABA: Gama-Aminobutyric Acid

CM: Cell Membrane

Cyto: Cytoblast

CW: Cell Wall

OM: Double-Stranded Ribonucleic Acid

SRP: Signal Recognition Particle

SP: Signal Peptide

SPase: Signal Peptidase

SLP: Surface (S)-Layer Protein

SLH: S-Layer Homology

PA: Protein Anchor

LPS: Lipopolysaccharide

NICE: Nisin Controlled Gene Expression System

SICE: Stress - Induced Controlled Expression

IP: Induction Peptide

HK: Histidine Kinase

SPL: Synthetic Promoter Library

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu được tài trợ bởi Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Tiền Giang trong khuôn khổ Đề tài mã số ĐTNN 05/19.

Nguyễn Thanh Tấn được tài trợ bởi Chương trình học bổng đào tạo thạc sĩ, tiến sĩ trong nước của Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF), mã số VINIF.2022.ThS.077.

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả cam kết không có xung đột lợi ích.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Các tác giả Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thanh Tấn viết, tổng hợp, và chỉnh sửa bản thảo. Tác giả Trần Văn Hiếu tham gia chỉnh sửa bản thảo. Tất cả các tác giả đồng ý với bản thảo cuối cùng khi nộp.

References

  1. Peterbauer C, Maischberger T, Haltrich D. Food-grade gene expression in lactic acid bacteria. Biotechnol J. 2011;6(9):1147-61. . ;:. Google Scholar
  2. Kleerebezem M, Hols P, Bernard E, Rolain T, Zhou M, Siezen RJ, et al. The extracellular biology of the lactobacilli. FEMS Microbiol Rev. 2010;34(2):199-230. . ;:. Google Scholar
  3. Michon C, Langella P, Eijsink VGH, Mathiesen G, Chatel JM. Display of recombinant proteins at the surface of lactic acid bacteria: Strategies and applications. Microb Cell Fact. 2016;15(1):70. . ;:. Google Scholar
  4. Pontes DS, De Azevedo MSP, Chatel JM, Langella P, Azevedo V, Miyoshi A. Lactococcus lactis as a live vector: Heterologous protein production and DNA delivery systems. Protein Expr Purif. 2011;79(2):165-75. . ;:. Google Scholar
  5. Assohoun-Djeni NMC, Djeni NT, Messaoudi S, Lhomme E, Koussemon-Camara M, Ouassa T, et al. Biodiversity, dynamics and antimicrobial activity of lactic acid bacteria involved in the fermentation of maize flour for doklu production in Côte d’Ivoire. Food Control. 2016;62:397-404. . ;:. Google Scholar
  6. Woraprayote W, Malila Y, Sorapukdee S, Swetwiwathana A, Benjakul S, Visessanguan W. Bacteriocins from lactic acid bacteria and their applications in meat and meat products. Meat Sci. 2016;120:118-32. . ;:. Google Scholar
  7. Matsumoto S, Hara T, Hori T, Mitsuyama K, Nagaoka M, Tomiyasu N, et al. Probiotic Lactobacillus-induced improvement in murine chronic inflammatory bowel disease is associated with the down-regulation of pro-inflammatory cytokines in lamina propria mononuclear cells. Clin Exp Immunol. 2005;140(3):417-26. . ;:. Google Scholar
  8. Von der Weid T, Bulliard C, Schiffrin EJ. Induction by a lactic acid bacterium of a population of CD4+ T cells with low proliferative capacity that produce transforming growth factor β and interleukin-10. Clin Diagn Lab Immunol. 2001;8(4):695-701. . ;:. Google Scholar
  9. Barla F, Koyanagi T, Tokuda N, Matsui H, Katayama T, Kumagai H. The γ-aminobutyric acid-producing ability under low pH conditions of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented foods of Ishikawa Prefecture, Japan, with a strong ability to produce ACE-inhibitory peptides. Biotechnol Rep (Amst). 2016;10:105-10. . ;:. Google Scholar
  10. Shehata MG, El Sohaimy SA, El-Sahn MA, Youssef MM. Screening of isolated potential probiotic lactic acid bacteria for cholesterol lowering property and bile salt hydrolase activity. Ann Agric Sci. 2016;61(1):65-75. . ;:. Google Scholar
  11. Halbmayr E, Mathiesen G, Nguyen TH, Maischberger T, Peterbauer CK, Eijsink VGH, et al. High-level expression of recombinant β-galactosidases in Lactobacillus plantarum and Lactobacillus sakei using a sakacin p-based expression system. J Agric Food Chem. 2008;56(12):4710-9. . ;:. Google Scholar
  12. De Vos WM. Gene expression systems for lactic acid bacteria. Curr Opin Microbiol. 1999;2(3):289-95. . ;:. Google Scholar
  13. Nguyen HM, Pham ML, Stelzer EM, Plattner E, Grabherr R, Mathiesen G. Constitutive expression and cell-surface display of a bacterial β-mannanase in Lactobacillus plantarum. Microb Cell Fact. 2019;18(1):147. . ;:. Google Scholar
  14. Åvall-Jääskeläinen S, Palva A. Lactobacillus surface layers and their applications. FEMS Microbiol Rev. 2005;29(3):511-29. . ;:. Google Scholar
  15. Watanabe M, Kinoshita H, Huang IN, Eguchi K, Tsurumi T, Kawai Y, et al. An adhesin-like protein, lam29, from Lactobacillus mucosae ME-340 binds to histone H3 and blood group antigens in human colonic mucus. Biosci Biotechnol Biochem. 2012;76(9):1665-71. . ;:. Google Scholar
  16. Kakikawa M, Yokoi KJ, Kimoto H, Nakano M, Kawasaki KI, Taketo A. Molecular analysis of the lysis protein Lys encoded by Lactobacillus plantarum phage φg1e. Gene. 2002;299(1-2):227-34. . ;:. Google Scholar
  17. Noda M, Miyauchi R, Danshiitsoodol N, Matoba Y, Kumagai T, Sugiyama M. Expression of genes involved in bacteriocin production and self-resistance in Lactobacillus brevis 174A is mediated by two regulatory proteins. Appl Environ Microbiol. 2018;84(7):e02810-17. . ;:. Google Scholar
  18. Desvaux M, Hébraud M, Talon R, Henderson IR. Secretion and subcellular localizations of bacterial proteins: a semantic awareness issue. Trends Microbiol. 2009;17(4):139-45. . ;:. Google Scholar
  19. Dilks K, Rose RW, Hartmann E, Pohlschröder M. Prokaryotic utilization of the twin-arginine translocation pathway: A genomic survey. J Bacteriol. 2003;185(4):1478-83. . ;:. Google Scholar
  20. Tillotson GS, Tillotson J. Bacterial secreted proteins: Secretory mechanisms and role in pathogenesis. Expert Rev Anti Infect Ther. 2009;7(6):691-707. . ;:. Google Scholar
  21. Fagerlund A, Lindbäck T, Granum PE. Bacillus cereus cytotoxins Hbl, Nhe and CytK are secreted via the Sec translocation pathway. BMC Microbiol. 2010;10:304. . ;:. Google Scholar
  22. Tjalsma H, Antelmann H, Jongbloed JDH, Braun PG, Darmon E, Dorenbos R, et al. Proteomics of protein secretion by Bacillus subtilis: Separating the “secrets” of the secretome. Microbiol Mol Biol Rev. 2004;68(2):207-33. . ;:. Google Scholar
  23. Stathopoulos C, Georgiou G, Earhart CF. Characterization of Escherichia coli expressing an Lpp′OmpA(46-159)-PhoA fusion protein localized in the outer membrane. Appl Microbiol Biotechnol. 1996;45(1-2):112-9. . ;:. Google Scholar
  24. Mathiesen G, Sveen A, Brurberg MB, Fredriksen L, Axelsson L, Eijsink VGH. Genome-wide analysis of signal peptide functionality in Lactobacillus plantarum WCFS1. BMC Genomics. 2009;10:425. . ;:. Google Scholar
  25. Brockmeier U, Caspers M, Freudl R, Jockwer A, Noll T, Eggert T. Systematic screening of all signal peptides from Bacillus subtilis: A powerful strategy in optimizing heterologous protein secretion in Gram-positive bacteria. J Mol Biol. 2006;362(3):393-402. . ;:. Google Scholar
  26. Caspers M, Brockmeier U, Degering C, Eggert T, Freudl R. Improvement of Sec-dependent secretion of a heterologous model protein in Bacillus subtilis by saturation mutagenesis of the N-domain of the AmyE signal peptide. Appl Microbiol Biotechnol. 2010;86(6):1877-85. . ;:. Google Scholar
  27. Perez-Martinez G, Kok J, Venema G, van Dijl JM, Smith H, Bron S. Protein export elements from Lactococcus lactis. Mol Gen Genet. 1992;234(3):401-11. . ;:. Google Scholar
  28. Dieye Y, Usai S, Clier F, Gruss A, Piard JC. Design of a protein-targeting system for lactic acid bacteria. J Bacteriol. 2001;183(14):4157-66. . ;:. Google Scholar
  29. Le Loir Y, Azevedo V, Oliveira SC, Freitas DA, Miyoshi A, Bermúdez-Humarán LG, et al. Protein secretion in Lactococcus lactis: An efficient way to increase the overall heterologous protein production. Microb Cell Fact. 2005;4:2. . ;:. Google Scholar
  30. Mathiesen G, Sveen A, Piard JC, Axelsson L, Eijsink VGH. Heterologous protein secretion by Lactobacillus plantarum using homologous signal peptides. J Appl Microbiol. 2008;105(1):215-26. . ;:. Google Scholar
  31. Sørvig E, Grönqvist S, Naterstad K, Mathiesen G, Eijsink VGH, Axelsson L. Construction of vectors for inducible gene expression in Lactobacillus sakei and L. plantarum. FEMS Microbiol Lett. 2003;229(1):119-26. . ;:. Google Scholar
  32. Karlskås IL, Maudal K, Axelsson L, Rud I, Eijsink VGH, Mathiesen G. Heterologous protein secretion in lactobacilli with modified pSIP vectors. PLoS One. 2014;9(3):e91125. . ;:. Google Scholar
  33. Leenhouts K, Buist G, Kok J. Anchoring of proteins to lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 1999;76(1-4):367-76. . ;:. Google Scholar
  34. Bielen A, Teparić R, Vujaklija D, Mrša V. Microbial anchoring systems for cell-surface display of lipolytic enzymes. Food Technol Biotechnol. 2014;52(2):179-86. . ;:. Google Scholar
  35. Samuelson P, Gunneriusson E, Nygren PÅ, Ståhl S. Display of proteins on bacteria. J Biotechnol. 2002;96(2):129-54. . ;:. Google Scholar
  36. Kleerebezem M, Boekhorst J, van Kranenburg R, Molenaar D, Kuipers OP, Leer R, et al. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(4):1990-5. . ;:. Google Scholar
  37. Desvaux M, Dumas E, Chafsey I, Hébraud M. Protein cell surface display in Gram-positive bacteria: from single protein to macromolecular protein structure. FEMS Microbiol Lett. 2006;256(1):1-15. . ;:. Google Scholar
  38. Narita J, Okano K, Tateno T, Tanino T, Sewaki T, Sung MH, et al. Display of active enzymes on the cell surface of Escherichia coli using PgsA anchor protein and their application to bioconversion. Appl Microbiol Biotechnol. 2006;70(5):564-72. . ;:. Google Scholar
  39. Fredriksen L, Kleiveland CR, Hult LT, Lea T, Nygaard CS, Eijsink VGH, et al. Surface display of N-terminally anchored invasin by Lactobacillus plantarum activates NF-κB in monocytes. Appl Environ Microbiol. 2012;78(16):5864-71. . ;:. Google Scholar
  40. Brinster S, Furlan S, Serror P. C-terminal WxL domain mediates cell wall binding in Enterococcus faecalis and other gram-positive bacteria. J Bacteriol. 2007;189(4):1244-53. . ;:. Google Scholar
  41. Visweswaran GRR, Leenhouts K, Van Roosmalen M, Kok J, Buist G. Exploiting the peptidoglycan-binding motif, LysM, for medical and industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(10):4331–45. . ;:. Google Scholar
  42. Fagan RP, Fairweather NF. Biogenesis and functions of bacterial S-layers. Nat Rev Microbiol. 2014;12(3):211–22. . ;:. Google Scholar
  43. Åvall-Jääskeläinen S, Palva A. Lactobacillus surface layers and their applications. FEMS Microbiol Rev. 2005;29(3):511–29. . ;:. Google Scholar
  44. Smit E, Jager D, Martinez B, Tielen FJ, Pouwels PH. Structural and functional analysis of the S-layer protein crystallisation domain of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356: Evidence for protein-protein interaction of two subdomains. J Mol Biol. 2002;324(5):953–64. . ;:. Google Scholar
  45. Åvall-Jääskeläinen S, Hynönen U, Ilk N, Pum D, Sleytr UB, Palva A. Identification and characterization of domains responsible for self-assembly and cell wall binding of the surface layer protein of Lactobacillus brevis ATCC 8287. BMC Microbiol. 2008;8:165. . ;:. Google Scholar
  46. Antikainen J, Anton L, Sillanpää J, Korhonen TK. Domains in the S-layer protein CbsA of Lactobacillus crispatus involved in adherence to collagens, laminin and lipoteichoic acids and in self-assembly. Mol Microbiol. 2002;46(2):381–94. . ;:. Google Scholar
  47. Johnson B, Selle K, O’Flaherty S, Goh YJ, Klaenhammer T. Identification of extracellular surface-layer associated proteins in Lactobacillus acidophilus NCFM. Microbiology. 2013;159(Pt 11):2269–82. . ;:. Google Scholar
  48. Boot HJ, Kolen CPAM, Andreadaki FJ, Leer RJ, Pouwels PH. The Lactobacillus acidophilus S-layer protein gene expression site comprises two consensus promoter sequences, one of which directs transcription of stable mRNA. J Bacteriol. 1996;178(18):5388–94. . ;:. Google Scholar
  49. Hynönen U, Åvall-Jääskeläinen S, Palva A. Characterization and separate activities of the two promoters of the Lactobacillus brevis S-layer protein gene. Appl Microbiol Biotechnol. 2010;87(2):647–54. . ;:. Google Scholar
  50. McCracken A, Turner MS, Giffard P, Hafner LM, Timms P. Analysis of promoter sequences from Lactobacillus and Lactococcus and their activity in several Lactobacillus species. Arch Microbiol. 2000;173(5–6):383–9. . ;:. Google Scholar
  51. Mesnage S, Weber-Levy M, Haustant M, Mock M, Fouet A. Cell surface-exposed tetanus toxin fragment C produced by recombinant Bacillus anthracis protects against tetanus toxin. Infect Immun. 1999;67(9):4847-50. . ;:. Google Scholar
  52. Åvall-Jääskeläinen S, Kylä-Nikkilä K, Kahala M, Miikkulainen-Lahti T, Palva A. Surface display of foreign epitopes on the Lactobacillus brevis S-layer. Appl Environ Microbiol. 2002;68(12):5943-51. . ;:. Google Scholar
  53. Huang SJ, Chen MJ, Yueh PY, Yu B, Zhao X, Liu JR. Display of Fibrobacter succinogenes β-glucanase on the cell surface of Lactobacillus reuteri. J Agric Food Chem. 2011;59(5):2131-8. . ;:. Google Scholar
  54. Hu S, Kong J, Sun Z, Han L, Kong W, Yang P. Heterologous protein display on the cell surface of lactic acid bacteria mediated by the S-layer protein. Microb Cell Fact. 2011;10:86. . ;:. Google Scholar
  55. Bosma T, Kanninga R, Neef J, Audouy SAL, van Roosmalen ML, Steen A, et al. Novel surface display system for proteins on non-genetically modified gram-positive bacteria. Appl Environ Microbiol. 2006;72(1):880-9. . ;:. Google Scholar
  56. Buist G, Steen A, Kok J, Kuipers OP. LysM, a widely distributed protein motif for binding to (peptido)glycans. Mol Microbiol. 2008;68(4):838-47. . ;:. Google Scholar
  57. Raha AR, Varma NRS, Yusoff K, Ross E, Foo HL. Cell surface display system for Lactococcus lactis: a novel development for oral vaccine. Appl Microbiol Biotechnol. 2005;68(1):75-81. . ;:. Google Scholar
  58. Hu S, Kong J, Kong W, Guo T, Ji M. Characterization of a novel LysM domain from Lactobacillus fermentum bacteriophage endolysin and its use as an anchor to display heterologous proteins on the surfaces of lactic acid bacteria. Appl Environ Microbiol. 2010;76(8):2410-8. . ;:. Google Scholar
  59. Xu W, Huang M, Zhang Y, Yi X, Dong W, Gao X, et al. Novel surface display system for heterologous proteins on Lactobacillus plantarum. Lett Appl Microbiol. 2011;53(6):641-8. . ;:. Google Scholar
  60. Kuczkowska K, Mathiesen G, Eijsink VGH, Øynebråten I. Lactobacillus plantarum displaying CCL3 chemokine in fusion with HIV-1 Gag-derived antigen causes increased recruitment of T cells. Microb Cell Fact. 2015;14:169. . ;:. Google Scholar
  61. Marraffini LA, DeDent AC, Schneewind O. Sortases and the art of anchoring proteins to the envelopes of Gram-positive bacteria. Microbiol Mol Biol Rev. 2006;70(1):192-221. . ;:. Google Scholar
  62. Navarre WW, Schneewind O. Proteolytic cleavage and cell wall anchoring at the LPXTG motif of surface proteins in Gram-positive bacteria. Mol Microbiol. 1994;14(1):115-121. . ;:. Google Scholar
  63. Proft T. Sortase-mediated protein ligation: an emerging biotechnology tool for protein modification and immobilisation. Biotechnol Lett. 2010;32(1):1-10. . ;:. Google Scholar
  64. Turner MS, Hafner LM, Walsh T, Giffard PM. Peptide surface display and secretion using two LPXTG-containing surface proteins from Lactobacillus fermentum BR11. Appl Environ Microbiol. 2003;69(10):5855-5863. . ;:. Google Scholar
  65. Fredriksen L, Mathiesen G, Sioud M, Eijsink VG. Cell wall anchoring of the 37-kilodalton oncofetal antigen by Lactobacillus plantarum for mucosal cancer vaccine delivery. Appl Environ Microbiol. 2010;76(21):7359-7362. . ;:. Google Scholar
  66. Tauer C, Heinl S, Egger E, Heiss S, Grabherr R. Tuning constitutive recombinant gene expression in Lactobacillus plantarum. Microb Cell Fact. 2014;13:150. . ;:. Google Scholar
  67. Rud I, Jensen PR, Naterstad K, Axelsson L. A synthetic promoter library for constitutive gene expression in Lactobacillus plantarum. Microbiology. 2006;152(Pt 4):1011-1019. . ;:. Google Scholar
  68. McCracken A, Timms P. Efficiency of transcription from promoter sequence variants in Lactobacillus is both strain and context dependent. J Bacteriol. 1999;181(20):6569-6572. . ;:. Google Scholar
  69. Duong T, Miller MJ, Barrangou R, Azcarate-Peril MA, Klaenhammer TR. Construction of vectors for inducible and constitutive gene expression in Lactobacillus. Microb Biotechnol. 2011;4(3):357-367. . ;:. Google Scholar


Author's Affiliation

  • Phuong-Thao Thi Nguyen

    Tien Giang University, Vietnam, Laboratory of Biosensors, Faculty of Biology - Biotechnology, University of Science, Ho Chi Minh City, Vietnam; Department of Molecular and Enviromental Biotechnology, Faculty of Biology - Biotechnology, University of Science, Ho Chi Minh City, Vietnam; Vietnam National University Ho Chi Minh City, Vietnam
    Google Scholar Pubmed

  • Nguyen Thanh Tan

    Faculty of Biology - Biotechnology, University of Science, Ho Chi Minh City, Vietnam; Department of Molecular and Enviromental Biotechnology, Faculty of Biology - Biotechnology, University of Science, Ho Chi Minh City, Vietnam; Vietnam National University Ho Chi Minh City, Vietnam
    Google Scholar Pubmed

  • Hieu Tran-Van

    Faculty of Biology - Biotechnology, University of Science, Ho Chi Minh City, Vietnam; Department of Molecular and Enviromental Biotechnology, Faculty of Biology - Biotechnology, University of Science, Ho Chi Minh City, Vietnam; Vietnam National University Ho Chi Minh City, Vietnam
    Email I'd for correspondance: tvhieu@hcmus.edu.vn
    Google Scholar Pubmed
Article Details

Issue: Vol 8 No 4 (2024)
Page No.: 3125-3138
Published: Dec 31, 2024
Section: Review
DOI: https://doi.org/10.32508/stdjns.v8i4.1268

 Copyright Info

Creative Commons License

Copyright: The Authors. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License CC-BY 4.0., which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

 How to Cite
Nguyen, P.-T., Tan, N., & Tran-Van, H. (2024). Protein display on lactic acid bacteria cell surface. VNUHCM Journal of Natural Sciences, 8(4), 3125-3138. https://doi.org/https://doi.org/10.32508/stdjns.v8i4.1268


 Download Citation
 Cited by

Article level Metrics by Paperbuzz/Impactstory
Article level Metrics by Altmetrics

 Article Statistics
HTML = 162 times
PDF   = 82 times
XML   = 0 times
Total   = 82 times