Open Access 
Abstract
This study was carried out to develop a method for the simultaneous analysis of 5-aminoglycosides such as streptomycin (STR), neomycin (NEO), kanamycin (KAN), spectinomycin (SPE), and amikacin (AMI) in animal feedstuffs using the (HPLC-ELSD) high performance liquid chromatography with Evaporative Light Scattering Detector detection. The 5-aminoglycoside antibiotics in animal feed samples were extracted with a solvent containing 20% ACN, 1% HCl (v/v). The extract was purified by solid-phase extraction (SPE) with the stationary phase of PCX, at pH 5 which was adjusted by NH3 solution. The 5-aminoglycosides were eluted from the SPR column with 10% NH3 solution. The eluted sample was evaporated to dryness and the residue was dissolved in 20 mM hepta fluorobutyric acid (HFBA) solution followed by filtering through a 0.22 µm membrane prior to analyze by HPLC – ELSD. The 5-aminoglycosides were separated on an Eclipse Plus C18, 1.8 µm, 4.6×100 mm column, an aqueous/acetonitrile containing 15 mM HFBA in gradient mode with ratio of H2O/ACN: 0-1 min fix at 76:25, 1-6 min reduce 55:45, 6-7 min fix at 55-45, 7-8 min increase to 75:25. A carrier gas velocity of the ELSD detector was 1 L/min and the misting temperature was 40oC. This method achieved a detection limit (MDL) of 4 mg/kg and a recovery yield of 87-92% for 5-aminoglycosides in feed sample with the HPLC – ELSD system.
MỞ ĐẦU
Thuốc kháng sinh là những chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, phần lớn trong số đó lúc đầu do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sinh ra. Với nồng độ thấp đã có tác dụng ức chế hay tiêu diệt sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây bệnh, nhưng không hay rất ít gây bệnh cho người, gia súc, gia cầm. Aminoglycoside (AG) là một nhóm kháng sinh lớn đặc trưng bởi hai hoặc nhiều nhóm aminosugar liên kết với nhau bằng liên kết glycoside tạo nên thành phần aminocyclitol. Các AG can thiệp vào quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách ức chế đảo ngược ribosome dẫn đến phá hủy màng tế bào vi khuẩn. Do đó, nó có khả năng cho phổ kháng khuẩn rộng kể cả gram âm và gram dương. Nhóm AG gồm nhiều loại thuốc kháng sinh như: streptomycin (STR), neomycin (NEO), kanamycin (KAN), spectinomycin (SPE), amikacin (AMI), apramycin (APR), tobramycin (TOB), paronomycin (PAR)… là những thuốc diệt khuẩn được ứng dụng rông rãi trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Các aminoglycoside (AG) có phổ kháng khuẩn rộng được ưa chuộng trong chăn nuôi và thuốc thú y như là chất kích thích tăng trưởng và các chất phụ gia thức ăn cải thiện tỷ lệ chuyển đổi thức ăn và thúc đẩy khả năng hấp thu chất dinh dưỡng cho động vật. Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài các AG sẽ gây ra các phản ứng phụ, dẫn tới nguy hại tiềm tàng đối với sức khoẻ con người 1 , 2 .
Với kháng sinh AG, phương pháp vi sinh được sử dụng phổ biến trong kiểm nghiệm, tuy nhiên phương pháp này gặp phải một số hạn chế: tốn nhiều thời gian, độ chính xác chưa thật cao, và đặc biệt khó khăn khi định lượng chế phẩm kháng sinh là hỗn hợp nhiều thành phần 3 . Để khắc phục hạn chế này, một số các phương pháp phân tích hiện đại thay thế phương pháp vi sinh đã được ứng dụng trong phân tích các hợp chất nhóm aminoglycoside như: phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 4 , phương pháp điện di mao quản (EC) 5 phương pháp sắc ký lớp mỏng 6 ... Tuy nhiên, do đặc điểm cấu tạo phân tử không có khả năng hấp thu tử ngoại hoặc phát huỳnh quang, cho nên muốn sử dụng được các đầu dò thông thường (huỳnh quang, UV – VIS ...) thì kháng sinh AG cần phải được tạo dẫn xuất hoá trước cột hoặc sau cột. Như phân tích AMI trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp đầu dò huỳnh quang sử dụng cột C18 LiChroCART Purospher (125 mm × 3 mm, 5 µm), pha động MeOH hoặc ACN theo tỷ lệ phù hợp với nước có 0,05% acid trifluoroacetic 7 . AMI được tạo dẫn xuất trước cột với ortho-phthaldialdehyde-3-acid mercaptopropionic. Hay định lượng AMI trong dịch sinh học, AMI và chất chuẩn nội chuẩn TOB được tách ra khỏi huyết tương bằng phương pháp sắc ký gel trao đổi ion, AMI sau khi được tách ở cột sắc ký, phản ứng với thuốc thử o-phthalaldehyde (OPA) và mercaptoethanol trong đệm borate pH = 10,4 tại 50 o C 8 . Kỹ thuật này phức tạp, quá trình phân tích trải qua nhiều giai đoạn và môi trường độc hại... Do đó cần thiết xây dựng một phương pháp định lượng trực tiếp định lượng các AG nhanh, trực tiếp, kỹ thuật đơn giản và có độ chính xác đảm bảo là cần thiết. Kháng sinh TOB trong thuốc, máu và nước tiểu được phân tích bằng HPLC-ELSD sử dụng cột Water ODS-2 C18 Spherisorb với nhiệt độ bay hơi là 45 o C, sử dụng khí mang là nitrogen, pha động H 2 O/ACN (55:45) chứa 11,6 mM acid heptafluorobutyric (HFBA). Phương pháp cho LOD 0,3 mg/L với hiệu suất thu hồi từ 99-103% 9 .
Đầu dò tán xạ bay hơi (ELSD) ghi nhận các tín hiệu các hợp chất dựa trên sự tán xạ laser trên các hạt rắn. Như vậy tất cả các chất hóa học ít bay hơi, khi hiện diện ở lượng đủ lớn có thể được phân tích bằng đầu dò. Một đặc tính độc đáo của ELSD mà không có đầu dò nào có được là độ nhạy của các các chất chỉ phụ thuộc vào nồng độ khối lượng (mg/L) chất đến đầu dò, tức là các chất có nồng độ như nhau thì cho tín hiệu bằng nhau 10 . Các hợp chất kháng sinh 5-aminoglycoside có nhiệt độ bay hơi cao, tồn tại trong mẫu thức ăn chăn nuôi ở hàm lượng lớn nên hoàn toàn phù hợp để phân tích trên đầu dò ELSD với chi phí thấp.
Nghiên cứu này nhằm phát triển phương pháp tin cậy nhằm phân tích các kháng sinh 5- aminoglycoside trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò tán xạ bay hơi (HPLC – ELSD). Phương pháp phân tích bao gồm tối ưu và các bước xử lý mẫu tách các kháng sinh 5-aminoglycoside từ nền thức ăn chăn nuôi, và tách và phát hiện trên hệ HPLC-ELSD. Phương pháp được phê duyêt trên các tiêu chí độ tuyến tính, giới han phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác, hiệu suất thu hồi trên nền thức ăn chăn nuôi nhằm hướng tới áp dụng cho kiểm nghiệm các kháng sinh này trên các loại mẫu thức ăn chăn nuôi thực tế tại các trung tâm phân tích.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Hóa chất
Các chất chuẩn aminoglycoside (AG): neomycin sulfate (NEO) 80,0%, streptomycin sulfate (STR) 99,0%, kanamycin sulfate (KAN) 98,4% (Dr. Ehrenstorfer, Đức) pectinomycin hydrocloride (SPE) 78,1%, amikacin sulfate (AMI) 89,5% (Sigma, Đức); acid heptafluorobutyric (HFBA), acid trifluoroacetic (TFA) (Acros, Đức); acetonitrile (ACN), methanol (MeOH), ammonia 25% (NH 3 ), acid acetic băng (Merck, Đức); nước khử ion.
Thiết bị, dụng cụ
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao UHPLC 1290 Infinity II LC (Agilent, Mỹ), đầu dò tán xạ bay hơi ELSD (Agilent, Mỹ), cột sắc ký InertSustain AQ C18 5 µm, 4,6 × 250 mm (GL Sciences, Nhật), cột Eclipse Plus C18, 1,8 µm, 4,6 × 100 mm (Agilent, Mỹ), cột chiết pha rắn Siliapred C18 500 mg/6 mL (Silicycle, Canada), cột chiết pha rắn Plexa 500 mg/6mL (Agilent, Mỹ), cột chiết pha rắn Plexa PCX 500 mg/6 mL (Agilent, Mỹ), hệ thống chiết SPE Sulpeco, hệ thống thổi khí nitrogen có gia nhiệt, máy ly tâm, vortex, và các dụng cụ khác.
Khảo sát các điều kiện sắc ký
Cột phân tích
hằm mục tiêu lựa chọn cột sắc ký phù hợp cho quá trình tách các AG, tiến hành khảo sát trên 2 cột sắc ký: c ột InertSustain AQ C18 5 µm, 4,6 × 250 mm và cột Eclipse Plus C18, 1,8 µm, 4,6 × 100 mm.
Điều kiện pha động
Acid trifluoracetic (TFA) và acid heptafluorobutyric (HFBA) đều có khả năng làm pha động do vừa có khả năng ghép cặp ion với các AG vừa là chất dễ bay hợp phù hợp với đầu dò ELSD. Cần khảo sát nồng độ của acid và chương trình rửa giải pha động vì nó ảnh hưởng đến thời gian lưu của các AG trên cột cũng như khả năng đáp ứng trên đầu dò ELSD. Khảo sát chế độ isocractic: với pha động TFA sử dụng tỉ lệ hai kênh A:B = 98:2. Với pha động HFBA các tỉ lệ pha động giữa hai kênh A và B theo các tỉ lệ 65% A và 35% B; 70% A và 30% B; 75% A và 25% B. Chế độ gradient pha động của HFBA 15 mM, tỉ lệ của các kênh A:B lần lượt theo thời gian: 0-1 phút 75:25; 1-6 phút 55:45; 6-7 phút 55:45; 7-8 phút 75:25.
Các thông số của đầu do ELSD
Dựa vào các thông số được thay đổi trên đầu dò như tốc độ khí mang, nhiệt độ phun sương, nhiệt độ bay hơi. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các thông số đầu dò: (i) Thay đổi tốc độ khí mang từ 1,00 đến 2,50 SLM; (ii) Khảo sát nhiệt độ phun sương ở các nhiệt độ 30 đến 80 o C; (iii) Nhiệt độ bay hơi được khảo sát ở 60 đến 85 o C.
Quy trình xử lý mẫu
Cân 1 g mẫu thức ăn chăn nuôi vào ống ly tâm 15 mL, thêm 10 mL dung dịch chiết mẫu, lắc 1 phút, ly tâm trong 10 phút. Sau đó, mẫu được ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút tại 4 o C. Phần dịch chiết được chuyển vào ống ly tâm mới, phần cặn được chiết thêm 1 lần nữa với 10 mL dịch chiết. Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành làm sạch trên cột chiết SPE. Dung dịch sau rửa giải được thổi khô và hòa tan lại bằng dung dịch HFBA 20 mM, lọc qua màng 0,22 µm và phân tích bằng HPLC-ELSD. Dựa vào quy trình xử lý mẫu này, tiến hành khảo sát các yếu tố:
Dung môi chiết mẫu
Thành phần dung môi chiết mẫu được khảo sát với các tỉ lệ dung môi: H 2 O:ACN:HCl với các tỉ lệ 100:400:0, 250:250:0, 390:100:10, 395:100:5, và 400:100:0 (v/v/v).
Loại cột SPE
Các hợp chất AG với phân tử có nhiều nhóm amino và các hydroxyl nên phân tử mang tính base yếu (pK a trong khoảng từ 7-9). Có nhiều loại cột SPE với các pha tĩnh khác nhau có thể được sử dụng để phân tích các AG. Do đó, cần phải khảo sát hiệu suất thu hồi của các AG khi chiết trên các loại cột này. Có 3 cột SPE được khảo sát: cột C18, PLEXA, và PCX.
Quy trình rửa giải trên cột PCX
Dựa vào kết quả khảo sát trên các loại cột chiết, tiến hành khảo sát quá trình rửa giải trên cột PCX. Đối với các phương pháp chiết bằng cơ chế trao đổi ion để đảm bảo cho quá trình chất phân tích hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh thì pH của dung dịch mẫu cần phải điều chỉnh phù hợp. Dịch chiết mẫu chứa HCl dẫn đến pH của dung dịch rất thấp, cần sử dụng NH 3 điều chỉnh pH về các giá trị pH 3, 5, và 7 để khảo sát hiệu suất thu hồi của các AG. Mẫu sau khi được đưa qua cột SPE sẽ được rửa giải bằng dung dịch NH 3 . Thay đổi nồng độ dung môi rửa giải NH 3 ảnh hưởng đến lực rửa giải của dung dịch từ đó thay đổi hiệu suất thu hồi của các AG trên cột chiết PCX và chọn một nồng độ NH 3 tối ưu. Các nồng độ NH 3 được khảo sát 5%, 10%, và 15%.
Thẩm định phương pháp
Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
hân tích các mẫu thêm chuẩn tại nồng độ thấp, thực hiện 6 lần song song. Dựa và tỉ số chiều cao của tín hiệu (S) và nhiễu nền (N) tương ứng để lựa chọn các dung dịch mẫu thêm chuẩn có kết quả 3≤ S/N ≤10 và các giá trị MDL = 3S/N, MQL = 3MDL.
Xác định khoảng làm việc
Xây dựng đường chuẩn của 5-aminoglycoside trong khoảng từ 5-140 mg/L. Đánh giá độ tuyến tính của đường chuẩn thông qua phương trình logA = b×logC + loga và hệ số tương quan R 2 .
Đánh giá độ lặp lại và độ tái lặp
Độ lặp lại được thực hiện dựa trên việc phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ 10, 20, và 50 mg/L. Phân tích trên 3 mẫu thức ăn chăn nuôi khác nhau, mỗi mẫu thực hiện lặp 10 lần ở mỗi nồng độ thêm chuẩn. Độ tái lặp được đánh giá qua việc thực hiện phân tích mẫu bởi 2 nhân viên khác nhau và tiến hành trong 10 ngày làm việc.
Đánh giá hiệu suất thu hồi
Hiệu suất thu hồi được thực hiện trên mẫu thức ăn chăn nuôi không chưa AG. Tiến hành phân tích đồng thời mẫu thêm chuẩn và mẫu không thêm chuẩn. Thực hiện phép thử trong thời gian 1 ngày và lặp lại 10 lần phép thử.
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
Điều kiện sắc ký
Tính chất hóa lý của cột sắc ký ảnh hưởng đến hiệu năng phân tích
Cột Inertsustain AQ C18 5 µm, 4,6 × 250 mm được tối ưu hóa cho lưu giữ cho các chất có độ phân cực cao trong sắc ký pha đảo sử dụng các nhóm octadecyl và khóa đuôi cho tương tác kỵ nước mạnh và linh hoạt giữ được nhiều hợp chất. Mặc dù cột AQ cho các mũi sắc ký tương ứng với các chất phân tích được tách ra khá rõ rệt tuy nhiên vài mũi sắc ký vẫn còn dính chân và chất phân tích rửa giải sau cùng bị mất độ nhạy do sự kéo đuôi ( Figure 1 ). Cột Eclipse Plus C18, 1,8 µm, 4,6 × 100 mm với kích thước hạt nhỏ nên làm tăng số đĩa lý thuyết nên tăng hiệu năng tách 5 AG. Thời gian phân tích ngắn chỉ khoảng 8 phút cho một mẫu ( Figure 2 ) nhờ vào chiều dài chỉ 10 cm nên giúp tiết kiệm thời gian cũng như hóa chất.
Ảnh hưởng của tác chất ghép cặn ion đến quá trình phân tích
TFA gặp nhiều hạn chế cho hiệu năng tách như bề rộng mũi sắc ký lớn, độ phân giải kém các mũi rửa giải gần nhau gây khó khăn cho việc tách, số đĩa lý thuyết thấp. Hơn nữa, pha động chạy là TFA 200 mM, nồng độ cao acid tức pH thấp ảnh hưởng đến tuổi thọ của cột sắc ký và ăn mòn thiết bị HPLC. Acid heptafluorobutyric (C 3 F 7 COOH - HFBA) là một acid hữu cơ tương tự như TFA nhưng có tính acid (pK a = 3,8) yếu hơn TFA (pK a = 0,52) nên ít làm hại cột hơn TFA. Ngoài ra phân tử có nhiều C hơn cho phép tạo cặp ion mạnh hơn so với TFA đảm bảo tách tốt các AG trên cột C 18 . Vì vậy nồng độ HFBA trong pha động mặc dù thấp hơn nhiều so với TFA (20 mM so với 200 mM) nhưng hiệu quả ghép cặp được chứng minh là cao hơn TFA ( Figure 3 và Figure 4 ). Ngoài ra, HFBA có phân tử khối là 213 đvC lớn hơn so với TFA có phân tử khối 113 đvC dẫn đến làm tăng độ nhạy cho các AG do bản chất của hiện tượng tán xạ ánh sáng.
Gradient pha động
Quá trình tách 5 hợp chất AG phụ thuộc vào chương trình rửa giải pha động để đảm bảo quá trình tách được hiệu quả nhất. Khi thành phần kênh B là 35% thì các hợp chất AG được rửa giải ra sớm và có hiện tượng chập vào nhau, khi giảm xuống còn 25% thì các AG được tách ra nhưng mũi sắc ký bị bành rộng làm giảm độ nhạy cũng như kéo dài thời gian phân tích ( Figure 5 ). Sử dụng chương trình rửa giải pha động để đảm bảo 5 hợp chất AG được tách hiệu quả tức vừa tốn ít thời gian vừa cho hệ số tốt nhất ( Figure 6 ).
Figure 5 . Sắc ký đồ hỗn hợp 5 AG 20 mg/L với các tỉ lệ pha động (chế độ pha động: isocratic)
Tối ưu nồng độ HFBA
Khi nồng độ HFBA khoảng 5 mM thì AMI và KAN bị chập peak ( Figure 7 ). Khi tăng nồng độ HFBA lên 10 mM thì hệ số rửa giải cải thiện hơn nhưng vẫn chưa tách nhau hoàn toàn. Tuy nhiên khi nồng độ HFBA lên 15 mM thì 5 hợp chất AG được tách ra rõ rệt các mũi sắc ký tương ứng không còn hiện tượng chập. Tăng nồng độ HFBA lên 20 mM thì có sự khác biệt không đáng kể so với nồng độ 15 mM.
Khi tăng nồng độ HFBA từ 5 mM lên 20 mM thời gian lưu của cả 5 AG đều tăng do tương tác của pha tĩnh và cặp ion được hình thành tỉ lệ thuận với nồng độ tác chất tạo cặp ion. Khi tăng nồng độ tác chất HFBA thì độ nhạy của các AG đối với đầu dò ELSD cũng tăng ( Figure 8 ), số lượng của những giọt hình thành trong buồng phun sương trên một đơn vị thời gian phụ thuộc tính chất pha động và tốc độ dòng chảy trong khi nó không phụ thuộc với nồng độ chất phân tích. Khi sử dụng HFBA ở nồng độ 15 mM thì cho hiệu quả tối ưu cả về thời gian tách trên cột và độ nhạy của đầu dò ELSD.
Tốc độ khí mang
Khi tốc độ dòng khí mang tăng từ 1,0 lít/phút lên 2,5 lít/phút thì độ đáp ứng của đầu dò ELSD đối với tất cả các AG đều có xu hướng giảm theo đường cong. Trong trường hợp tốc độ dòng pha động được cố định thì khi tăng tốc độ dòng khí mang, các AG khi được phun sương bị pha loãng do khí mang dẫn đến độ nhạy của chúng giảm ( Figure 9 ).
Nhiệt độ phun sương
Kiểm soát nhiệt độ buồng phun sương không chỉ góp phần giữ ổn định hình dạng các sol khí trước khí được gia nhiệt bay hơi mà còn giúp loại bỏ các hạt dung môi có kích thước lớn gây nhiễu. Nhiệt độ phun sương có ảnh hưởng thì độ nhạy của đầu dò ELSD đối với các AG. Độ nhạy cao nhất đạt được tại nhiệt độ phun sương là 40 o C. Khi tăng nhiệt độ phun sương thì độ nhạy giảm nhẹ và không thay đổi trong khoảng nhiệt độ từ 60 o C đến 80 o C ( Figure 10 ). Điều này đạt được do các hạt sương hình thành trong buồng phun được hoàn toàn.
Nhiệt độ bay hơi
Để cho quá trình bay hơi pha động hoàn toàn và hạn chế mất mát của chất phân tích thì cần phải xác định nhiệt độ bay hơi thích hợp để pha động và chất phân tích bay hơi với tốc độ dòng pha động cho đầu dò ELSD. Khi lựa chọn nhiệt độ bay hơi nhiệt độ thấp, nhiễu nền quá cao, mũi sắc ký nhọn hoặc trong trường hợp nhiệt độ quá cao độ nhạy giảm. Ngoài sự mất mát chất phân tích, nhiệt bay hơi quá cao gây bốc hơi dung môi quá nhiều làm phá hủy tính thống nhất của kích thước hạt và dẫn đến việc hình thành chất lỏng thay vì các hạt rắn. Khi tăng nhiệt độ bay hơi thì độ nhạy của các AG tăng do các AG là các kháng sinh có nhiệt độ bay hơi tương đối cao nên để đảm bảo quá trình bay hơi được hoàn toàn cũng như hạn chế nhiễu nền, nhiệt độ bay hơi nên trong khoảng 80 o C ( Figure 11 ).
Điều kiện chiết
Hiệu suất thu hồi trên các cột SPE
Các cột SPE đều có khả năng làm sạch đối với các AG. Tuy nhiên, đối với cột C18 thì cho hiệu suất thu hồi các AG thấp (SPE là 49%, STR là 54%, AMI là 43%, KAN là 60%, NEO là 55%).Đà 55%).ối với cột C18 thì cho hiệu suất thu hồi các AG thấp (SPE là 49%, STR là 54%, AMI là 43%, KAN là 60%, NEOcao nên để đảm bảo đ 55%).ối với cột C18 thì cho hiệu suất thu hồi các AG thấp (SPE là 49%, STR là 54%, AMI là 43%, KAN là 60%, NEOcao nên để đảm 18 nhưng hối với cột C18 thì cho hiệu suất thu hồi các AG thấp (SPE là 49%, STR là 54%, AMI là 43%, KAN là 60%, NEOcao nên để đảlà 87% và NEO là 86%) ( Figure 12 ).
Nồng độ dung môi ACN chiết mẫu
Nồng độ ACN ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi của các AG. Khi nồng độ ACN càng tăng thì hiệu suất thu hồi càng thấp. Khi nồng độ ACN là 20% thì vừa đủ để loại protein và cho hiệu suất thu hồi cao ( Figure 13 ). Nếu nồng độ ACN thấp hơn có thể dẫn đến các quá trình loại protein không hiệu quả ảnh hưởng đến quá trình chiết các AG ra khỏi nền mẫu.
Nồng độ HCl trong dịch chiết
Nồng độ HCl trong dung dịch chiết mẫu có ảnh hưởng đến hiệu thu hồi của các AG. Cụ thể là khi có HCl thì hiệu suất thu hồi có xu hướng tăng. Tại nồng độ HCl là 1% và 2% thì hiệu suất thu hồi gần như là không khác biệt đáng kể ( Figure 14 ).
Quá trình làm sạch
pH của dịch chiết trước khi lên cột PCX
Khi pH 7 thì hiệu suất thu hồi của các AG thấp (SPE là 63%, STR là 54%, AMI là 60%, KAN là 53%, NEO là 58%). Khi giảm pH xuống thì hiệu suất thu hồi tăng đáng kể, tại pH 5 có hiệu suất thu hồi cao hơn so với tại pH 3 ( Figure 15 ). Cột chiết PCX hoạt động dựa trên cơ chế trao đổi cation của nhóm acid sulfonic nên nó có tính chọn lọc cao đối với các hợp chất mang tính kiềm. Các AG có tính kiềm yếu nên để có thể hấp phụ lên trên cột PCX thì chúng phải được cation hóa trước. Tuy nhiên nếu trong môi trường pH 3 thì các AG bị cạnh tranh dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp hơn.
Nồng độ NH3 trong dung dịch rửa giải cột PCX
Khi tăng nồng độ NH 3 trong dung dịch rửa giải thì hiệu suất thu hồi các AG tăng đáng kể ( Figure 16 ). Cụ thể tại nồng độ NH 3 10% thì hiệu suất thu hồi SPE là 91%, STR là 88%, AMI là 86%, KAN là 88%, NEO là 88%. Khi tăng thêm nồng độ NH 3 15% thì hiệu suất thu hồi tăng không đáng kể mà lại gây khó khăn cho quá trình thổi khô làm giàu mẫu.
Thẩm định phương pháp
Giới hạn phát hiện và độ chính xác của phương pháp
Phân tích các mẫu thêm chuẩn tại nồng độ thấp làm 6 lần song song, thu được chiều cao tín hiệu và nhiễu nền tương ứng. Tính hệ số S/N, lựa chọn các dung dịch mẫu trắng thêm chuẩn cho tỷ lệ 3≤ S/N ≤10, giá trị MDL = 3S/N, MQL = 3S/N ( Table 1 ).
Khoảng làm việc
Đường chuẩn phân tích 5-aminoglycoside được xây dựng trong khoảng nồng độ từ 5-140 mg/L. Phương trình tuyến tính giữa nồng độ và tính hiệu chất phân tích ( Table 2 ) có dạng: logA = b × logC + loga. Các giá trị R 2 > 0,995, đảm bảo yêu cầu của đường chuẩn.
Độ lặp lại
Thực hiện phép thử trong thời gian 1 ngày và lặp lại 10 lần phép thử. Mỗi lần thực hiện phép thử đều trải qua các bước xử lý mẫu và tính toán kết quả độc lập nhau. Kết quả được trình bày trong Table 3 .
Độ tái lặp
Hiệu suất thu hồi
Thực hiện phép thử trong thời gian 1 ngày và lặp lại 10 lần phép thử. Mỗi lần thực hiện phép thử đều trải qua các bước xử lý mẫu và tính toán kết quả độc lập nhau, tính độ thu hồi theo công thức:
Trong đó, C obs : hàm lượng chất phân tích đo được trong mẫu thêm chuẩn; C s pike : hàm lượng lý thuyết thêm vào trong mẫu trắng.
Đối chiếu kết quả ( Table 5 ) với Table 4 giá trị hiệu suất thu hồi chấp nhận của AOAC thì giá trị hiệu suất thu hồi trong khoảng từ 80% đến 110% 11 .
Kết quả phân tích mẫu thức ăn chăn nuôi
Dựa vào sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn tại giới hạn định lượng của các mẫu hỗn hợp cho gà, chim cút từ 1 đến 28 ngày tuổi, thức ăn chăn nuôi hỗn hợp cho gà, chim cút đẻ trứng giống, thức ăn chăn nuôi hỗn hợp cho lợn nhỏ hơn 60 kg nhận thấy tại các thời gian của mẫu trắng không có tín hiệu của các AG.
Mẫu thức ăn chăn nuôi được bổ sung neomycin (NEO)
KẾT LUẬN
Phương pháp HPLC-ELSD dùng phân tích các kháng sinh họ 5-aminoglycoside trong nền thức ăn chăn nuôi đã được tối ưu và được phê duyệt. Các kháng sinh đã được ly trích định lượng với hệ dung môi ACN 20%, HCl 1% và đã được làm sạch trên cột SPE Plexa PCX. Các kháng sinh 5-aminoglycoside được tách tốt trên cột Eclipse Plus C18 1,8 µm, 4,6 × 100 mm với hệ pha động nước/acetonitrile có chất ghép cặp ion acid heptafluorobutyric. Thẩm định phương pháp cho thấy các hợp chất kháng sinh trong nền thức ăn chăn nuôi 5-aminoglycoside phân tích bằng HPLC-ELSD có giới hạn phát hiện 4 mg/kg, khoảng làm việc từ 5-140 mg/L, hiệu suất thu hồi trong khoảng 87-92%. Như vậy phương pháp này có đủ điều kiện áp dụng cho phân tích các kháng sinh họ 5-aminoglycoside và có thể được triển khai áp dụng trong các phòng thí nghiệm ở các trung tâm dịch vụ phân tích.
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu được tài trợ bởi Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM trong khuôn khổ đề tài HH 2021-06 .
DANH MỤC VIẾT TẮT
AG: aminoglycoside, NEO: neomycin sulfate, STR: streptomycin sulfate, KAN: kanamycin sulfate, SPE: spectinomycin hydrocloride, AMI: amikacin sulfate
LOD: giới hạn phát hiện
LOQ: giới hạn định lượng
S/N: Signal/noise
RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối
ELSD: đầu dò tán xạ bay hơi
HPLC: sắc ký lỏng hiệu năng cao
XUNG ĐỘT LỢI ÍCH
Các tác giả đồng ý không có bất kỳ xung đột lợi ích nào liên quan đến các kết quả đã công bố
ĐÓNG GÓP CỦA TÁC GIẢ
Nguyễn Văn Đông: định hướng, lên kế hoạch nghiên cứu, thực hiện các thí nghiệm, thu thập, xử lý các dữ liện, hoàn thiện bản thảo.
Đỗ Thị Tú Trinh: hỗ trợ xử lý dữ liệu
Tô Thị Hồng Chuyên: hỗ trợ hoàn thiện bản thảo
Nguyễn Minh Thịnh: lên kế hoạch, thực hiện thí nghiệm, thu thập, xử lý số liệu, viết bản thảo.
Trịnh Thị Diệu Bình: hỗ trợ định hướng nghiên cứu, lên kế hoạch nghiên cứu.
References
- Stead DA. Current methodologies for the analysis of aminoglycosides. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences Applications. 2000;747(1-2):69-93. . ;:. PubMed Google Scholar
- Watanabe T, Ohashi K, Matsui K, Kubota T. Comparative studies of the bactericidal, morphological and post-antibiotic effects of arbekacin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 1997;39(4):471-6. . ;:. PubMed Google Scholar
- Nouws J, van Egmond H, Smulders I, Loeffen G, Schouten J, Stegeman H. A microbiological assay system for assessment of raw milk exceeding EU maximum residue levels. International Dairy Journal. 1999;9(2):85-90. . ;:. Google Scholar
- Wichert BS, Hans Derendorf, Hartmut Sensitive liquid chromatography assay for the determination of amikacin in human plasma. Journal of pharmaceutical biomedical analysis. 1991;9(3):251-4. . ;:. PubMed Google Scholar
- Ackermans ME, FM Beckers, JL. Determination of aminoglycoside antibiotics in pharmaceuticals by capillary zone electrophoresis with indirect UV detection coupled with micellar electrokinetic capillary chromatography. Journal of Chromatography A. 1992;606(2):228-35. . ;:. PubMed Google Scholar
- Argekar AR, SV Kapadia, SU Determination of amikacin in parenteral dosage forms by high-performance thin-layer chromatography. JPC Journal of planar chromatography, modern TLC. 1996;9(6):459-61. . ;:. Google Scholar
- Baranowska I, Markowski P, Baranowski J. Simultaneous determination of 11 drugs belonging to four different groups in human urine samples by reversed-phase high-performance liquid chromatography method. Analytica Chimica Acta. 2006;570(1):46-58. . ;:. Google Scholar
- Wichert B, Schreier H, Derendorf H. Sensitive liquid chromatography assay for the determination of amikacin in human plasma. Journal of pharmaceutical biomedical analysis. 1991;9(3):251-4. . ;:. PubMed Google Scholar
- Megoulas NC, Koupparis MA. Development and validation of a novel HPLC/ELSD method for the direct determination of tobramycin in pharmaceuticals, plasma, and urine. Analytical Bioanalytical Chemistry. 2005;382(2):290-6. . ;:. PubMed Google Scholar
- Megoulas NCK, Michael A Twenty years of evaporative light scattering detection. Critical reviews in analytical chemistry. 2005;35(4):301-16. . ;:. Google Scholar
- Analysis AOMo. Appendix F: guidelines for standard method performance requirements. AOAC International Gaithersburg, MD; 2016. . ;:. Google Scholar
