Study on the xanthine oxidase inhibitory activity of some medicinal plants in Vietnam

Abstract

Xanthine oxidase is a crucial enzyme catalyzing the hydroxylation of hypoxanthine to xanthine and then xanthine into uric acid. Uric acid undergoes no further metabolism in humans and is excreted by the kidneys and intestinal tract. Hyperuricemia, associated with gout, results from the overproduction or underexcretion of uric acid. Xanthine oxidase inhibitors that block the terminal step in uric acid biosynthesis can lower the plasma uric acid concentration and are generally employed for the treatment of gout. Moreover, superoxide anion radicals generated by xanthine oxidase are involved in various pathological states such as hepatitis, inflammation, ischemia-reperfusion, carcinogenesis and aging. Thus, the search for novel xanthine oxidase inhibitors would be beneficial not only to treat gout but also to combat various other diseases. In this paper, results on investigating of xanthine oxidase inhibitory activity of 22 methanolic extracts from 18 medicinal plants in Vietnam, belonging to Moraceae, Anacardiaceae, Fabaceae, Euphorbiaceae, Boraginaceae, Rutaceae, Taxaceae, Gnetaceae, Plantaginaceae, Musaceae and Sapotaceae family were reported. The results indicated that 21 methanol extracts showed the inhibition at the concentration of 100 µg mL-1, 12 extracts showed greater than 50% inhibition at 100 µg mL-1, 6 showed greater than 50% inhibition at 100 µg mL-1 and 4 demonstrated over 50% inhibition at 25 µg mL-1. Among them, the methanol extracts from the stem of Buchanania lucida and Swintonia floribunda, belonging to Dipterocarpaceae family, displayed the highest xanthine oxidase inhibitors activity, with the IC50 values of 14.20 µg mL-1 and 15.76 µg mL-1, respectively. To the best of our knowledge, this is the first time that these extracts possessing the xanthine oxidase inhibitors activity were reported. The results of this study suggest that these herbs have potential for the treatment of rheumatism and inflammatory in Vietnam.

GIỚI THIỆU

Xanthine oxidase (XO; EC 1.1.3.22) là một enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp uric acid. Enzyme này xúc tác phản ứng oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và phản ứng oxy hóa xanthine thành uric acid. Thông thường, uric acid được cơ thể bài tiết ra ngoài qua đường tiểu, tuy nhiên, do uric acid là hợp chất kém phân cực, tan kém trong nước, nên nếu uric acid trong máu có hàm lượng cao, trong nhiều ngày, sẽ dẫn đến sự kết tủa các tinh thể urate trong dịch khớp, sụn xương, gân, các mô dưới da và các mô khác của cơ thể để gây ra bệnh gout. Việc hình thành các tinh thể muối sodium urate ở các khớp xương sẽ gây đau, viêm khớp và dần dần có thể phá hủy các khớp xương. Ngoài ra, uric acid được đào thải chủ yếu qua đường thận, việc hình thành các tinh thể sodium urate cũng có nguy cơ lắng đọng trong kẽ thận, gây sỏi thận (bệnh thận do gout) 1 , 2 , 3 .

Trong điều trị bệnh gout, để giảm uric acid trong máu, có thể sử dụng thuốc ngăn chặn sự tạo thành uric acid bằng cách ức chế enzyme XO. Việc tìm kiếm những sản phẩm có khả năng điều trị bệnh gout có nguồn gốc từ thiên nhiên là vấn đề thời sự, luôn được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Đã có một số quốc gia công bố về việc nghiên cứu sử dụng các dược liệu và ly trích các hoạt chất điều trị bệnh gout thông qua việc ức chế XO trên mô hình in vitro như Trung Quốc, Úc, Chi Lê, Paraguay, Panama, Ấn Độ v.v. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Các nghiên cứu cho thấy, nhóm hợp chất có hoạt tính ức chế XO mạnh thường là các flavonoid, polyphenol, stilbene, chalcone v.v.. Với nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và những kinh nghiệm lâu đời sử dụng cây cỏ làm thuốc, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã phát hiện các cây thuốc như Ngải cứu ( Artemisia vulgaris ), Tô mộc ( Caesalpinia sappan ), Đại bi ( Blumea balsamifera ), Dây chiều ( Tetracera scandens ) Mán đĩa ( Archidendron clyearia ), Lá bỏng ( Bryophyllum pinnatum ), Bình bát ( Annona glabra ) cây Nở ngày đất ( Gomphrena celosiodes Mart.), lá Trầu không ( Piper petle ), Dâu tằm ( Morus alba ), Cây gai ( Boehmeria nivea L.) có hoạt tính ức chế XO 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Table 1 Thông tin về tên khoa học, họ và công dụng dân gian của các dược liệu

Với mong muốn nghiên cứu phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gout từ dược liệu trong nước, bài báo này trình bày kết quả sàng lọc các dược liệu đối với hoạt tính ức chế enzyme XO của 22 cao chiết từ các bộ phận của 18 cây thuốc, được thu hái tại các địa phương khác nhau ở Việt Nam ( Table 1 ). Các mẫu dược liệu này được lựa chọn ngẫu nhiên cũng như dựa vào tính mới và công dụng dân gian như kháng viêm, giảm đau, chữa thống phong 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu dược liệu được thu hái ở các địa phương khác nhau ở Việt Nam, được định danh bởi PGS.TS. Trần Hợp, Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. HCM 24 , 25 . Các mẫu được mã hóa và lưu giữ tại Bộ môn Hóa dược, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ( Table 2 ).

Mẫu sau khi thu hái được phơi khô (độ ẩm < 12%), mỗi mẫu khoảng 100 g được xay nhỏ, rồi chiết bằng Soxhlet với dung môi MeOH (1.5 L) đến kiệt, thu được dịch trích MeOH. Sau khi thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không áp suất kém, thu được cao MeOH (độ ẩm < 10%).

Table 2 Mã lưu trữ và địa phương thu hái của các mẫu dược liệu

Hóa chất và thiết bị

Xanthine oxidase (25 Units) và xanthine (≥ 99,5%) được mua từ Sigma Aldrich, Đức, HCl (37%), Na ₂ HPO ₄ (≥ 99%), NaH ₂ PO ₄ (≥ 99 %) được mua từ Merck, Đức, DMSO, methanol và ethanol với độ tinh khiết > 99%, được mua từ Scharlau (Thái Lan) cuvette thủy tinh 5 mL của Hellma (Đức), máy quang phổ UV-1800 của SHIMADZU (Nhật Bản).

Phương pháp thử hoạt tính ức chế xanthine oxidase

Xanthine oxidase, một enzyme thân oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine tạo thành uric acid, đồng thời hình thành gốc tự do anion superoxyde và uric acid, có bước sóng cực đại hấp thu UV tại 293 nm ( Figure 1 ). Nếu trong mẫu thử có sự hiện diện của hợp chất ức chế enzyme XO thì cường độ hấp thu UV sẽ giảm. Dựa vào độ hấp thu của dung dịch khi có và không có mẫu thử sẽ tính được phần trăm ức chế enzyme của mẫu khảo sát.

Figure 1 . Phản ứng chuyển hóa xanthine thành uric acid

Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu khảo sát đối với enzyme XO, trong quy trình này sử dụng allopurinol làm chất đối chứng dương, vì đây là một hợp chất ức chế enzyme XO rất tốt và được sử dụng làm thuốc để điều trị bệnh gout cũng như được sử dụng trong các tài liệu tham khảo.

Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO

Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO được tiến hành như sau: mẫu được hòa tan trong đệm phosphate pH 6,8 và DMSO với tỉ lệ (97:3 v/v ). Dung dịch mẫu (300 μL) được thêm 100 μL enzyme XO, 0.05 U mL ^-1 , lắc đều dung dịch và ủ trong 15 phút tại nhiệt độ phòng. Dung dịch sau ủ, thêm tiếp 900 μL dung dịch nền xanthine 150 µM, lắc đều dung dịch và ủ trong 30 phút tại nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm tiếp 200 μL dung dịch HCl 1 M, lắc đều dung dịch rồi đo quang tại bước sóng 293 nm.

Mỗi mẫu được thử ở 4 nồng độ khác nhau (100, 50, 25, 10 µg mL ^-1 ), mỗi nồng độ đo 3 lần. Tương ứng với mỗi nồng độ mẫu thử luôn có một mẫu trắng; mẫu trắng tương tự như mẫu thử nhưng thay dung dịch enzyme bằng dung dịch đệm. Mỗi mẫu thử được kèm với mẫu đối chứng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử, khi đó thay dung dịch mẫu bằng dung môi ethanol (mẫu đối chứng không chứa mẫu thử). Từ đó tính được giá trị phần trăm ức chế (I%) với từng nồng độ khảo sát là trung bình cộng của 3 giá trị mật độ quang đo được ở mỗi nồng độ.

Đánh giá kết quả thử hoạt tính

Khả năng ức chế của mẫu khảo sát được tính dựa trên giá trị phần trăm ức chế theo công thức:

Trong đó:

a là Giá trị mật độ quang của dung dịch không chứa mẫu khảo sát.

b là Giá trị mật độ quang của dung dịch chứa mẫu khảo sát.

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel 365. Sử dụng phương pháp phân tích phương sai một chiều (ANOVA), kết quả được tính dựa trên giá trị trung bình với độ lệch chuẩn p < 0,05 cho thấy ý nghĩa thống kê.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Table 3 trình bày kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO của 22 mẫu cao chiết của 18 cây thuốc thu hái tại các địa phương khác nhau ở Việt Nam, cùng với chất đối chứng dương là allopurinol. Table 3 cho thấy, 20/22 mẫu cao có khả năng ức chế trong khoảng 0,7- 99% hoạt tính XO tại nồng độ 100 µg mL ^-1 ; trong đó, có 13 mẫu cao có khả năng ức chế tại 4 nồng độ 100 µg mL ^-1 , 50 µg mL ^-1 , 25 µg mL ^-1 và 10 µg mL ^-1 . Bên cạnh đó, số liệu còn cho thấy 12/22 mẫu cao có có khả năng ức chế lớn hơn 50% tại nồng độ 100 µg mL ^-1 ; trong đó, có 6 mẫu cao có khả năng ức chế lớn hơn 50% tại nồng độ 50 µg mL ^-1 và 4 mẫu cao có khả năng ức chế lớn hơn 50% tại nồng độ 25 µg mL ^-1 . Như vậy, kết quả khảo sát cho thấy có 12 mẫu cao có hoạt tính ức chế enzyme XO với giá trị IC ₅₀ 14,20–99,88 µg mL ^-1 . Đặc biệt, có hai mẫu cao là thân Chay sáng ( Buchanania lucida ) và thân Xuân thuôn nhiều hoa ( Swintonia floribunda ) có hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh nhất với giá trị IC ₅₀ lần lượt là 14,20 và 15,76 µg mL ^-1 so với hợp chất đối chứng dương alopurinol có giá trị IC ₅₀ là 0,35 µg mL ^-1 .

Trong những năm trở lại đây, nhóm nghiên cứu của chúng tôi cũng đã tiến hành khảo sát thành phần hóa học của một số dược liệu như vỏ thân và thân cây Xoài bụi ( Mangifera camptosperma ), thân cây Quéo ( Mangifera reba ), thân cây Sưng có đuôi ( Semeca r pus caudata ), thân cây Chay sáng ( Buchanania lucida ), thân Mít nài ( Artocarpus rigida ), hoa Cúc trắng ( Chrysanthemum maximum ) và đã phân lập được một số hợp chất thuộc nhóm: lignan, chalcone, antraquinone, flavonoid… 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Từ đó cho thấy, các dược liệu đã được khảo sát có thành phần hóa học chủ yếu là các hợp chất polyphenol nên các mẫu cao này có hoạt tính ức chế enzyme XO tương tự với các hợp chất trước đây đã công bố. Hơn thế nữa, đây là công bố đầu tiên về hoạt tính ức chế enzyme XO của các mẫu dược liệu này.

Hiện nay, vẫn chưa có công bố nào về thành phần hóa học của Hạt Chuối cô đơn ( Ensete glaucum ), cho thấy đây là dược liệu tiềm năng cần được nghiên cứu để phân lập các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO. Ngoài ra, các nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của dây Gắm ( Gnetum montanum ) cho thấy rằng thành phần chính của nó là các hợp chất stilbene và lignan, cả 2 nhóm hợp chất này đều cho thấy có khả năng ức chế enzyme XO, tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về thành phần hóa học của 2 dược liệu này vẫn còn rất hạn chế. Do đó, hai dược liệu là thân Gắm (Vương tôn) và hạt Chuối cô đơn là 2 dược liệu cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như hoạt tính ức chế enzyme XO.

Table 3 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO các mẫu cây thuốc

KẾT LUẬN

Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO của 22 mẫu cao, được sàng lọc từ các bộ phận của 18 dược liệu, cho thấy có 12 mẫu cao có hoạt tính ức chế enzyme XO với giá trị IC ₅₀ 14,20– 99,88 µ g mL ^-1 , trong số này, hai mẫu cao thân Chay sáng ( Swintonia floribunda ) và thân Xuân thuôn nhiều hoa ( Swintonia floribunda ) có hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh nhất với giá trị IC ₅₀ lần lượt là 14,20 và 15,76 µ g mL ^-1 . Kết quả cũng là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về phân lập các hoạt chất cũng như tạo nguồn nguyên dược liệu mới trong hỗ trợ điều trị bệnh gout.

Lời cám ơn

Nghiên cứu được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh (ĐHQG-HCM) trong khuôn khổ Chương trình mã số NCM2020-18-01

Danh mục viết tắt

XO: Xanthine oxidase

Xung đột lợi ích

Các tác giả cam đoan không có bất kỳ xung đột lợi ích nào trong bài báo này.

Đóng góp của các tác giả

Đỗ Văn Nhật Trường viết bản thảo bài báo, Lý Tú Phương thu hái mẫu, Nguyễn Xuân Hải điều chế cao, Trịnh Hoàng Ngân và Lê Hữu Thọ thử hoạt tính sinh học, Nguyễn Thị Thanh Mai phân bố cục và chỉnh sửa bản thảo chi tiết. Tất cả các tác giả đã đọc và chấp nhận bản thảo cuối cùng.